芍藥苷干預(yù)施萬細(xì)胞外泌體對(duì)背根神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用

韓 朔 李 瀟 楊鑫偉 朱笳悅 朱晏伯 許利平

施萬細(xì)胞(Schwann cell，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中特有的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)發(fā)揮著重要作用，是糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)中的主要靶細(xì)胞[1,2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血液中外泌體(exosomes，EXOs)能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，SCs分泌的EXOs裝載和傳遞信號(hào)分子，能夠影響神經(jīng)元細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[3,4]。氧化應(yīng)激是DPN的主要發(fā)病機(jī)制，有研究發(fā)現(xiàn)，EXOs所攜帶的核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor elytroid-derived factor 2-related factor，Nrf2)等蛋白含量發(fā)生改變，加重氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(dorsal root ganglion neurons, DRGn)[5]。SCs分泌的EXOs是否通過傳遞氧化應(yīng)激信號(hào)影響DRGn尚不清楚。本研究通過高糖環(huán)境誘發(fā)的施萬細(xì)胞氧化應(yīng)激，觀察芍藥苷(paeoniflorin，PF)對(duì)SCs分泌的EXOs 對(duì)DRGn的作用，探討PF的作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：(1)細(xì)胞：施萬細(xì)胞株RSC96 CRL-2765，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。(2)動(dòng)物：5～7天齡新生SD乳鼠，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，實(shí)驗(yàn)單位使用許可編號(hào)：SYXK(京)2018-0003。(3)試劑：Rabbit anti-beta Ⅲ Tubulin(ab18027)、Rabbit anti-Heme Oxygenase 1(ab68477)、Rabbit anti-CD63(ab217345)、Rabbit anti-p75 NGF(ab8874)、Rabbit Anti-Flotillin 1(ab41927)均購自英國Abcam公司。anti-Bax(sc-7480)、anti-Bcl-2(sc-7382)、anti-Casepase 3(sc-56053)、anti-GADD153(sc-7351)均購自美國Santa Cruz公司。芍藥苷(110736-201035，純度96.5%)購自中國藥品生物制品檢定所。(4)實(shí)驗(yàn)儀器：超速離心機(jī)(美國Beckman公司，L-80XP)，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司，TCS SP8)，透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司，HD7700)。

2.SCs細(xì)胞分組：將SCs分為空白對(duì)照組(25mmol/L葡萄糖DMEM+10%FBS)、模型對(duì)照組(150mmol/L葡萄糖DMEM+10%FBS)、PF1低劑量組(150mmol/L葡萄糖DMEM+10%FBS+1μmol/L PF)、PF10中劑量組(150mmol/L葡萄糖DMEM+10%FBS+10μmol/L PF)和PF100高劑量組(150mmol/L葡萄糖DMEM+10%FBS+100μmol/L PF)，培養(yǎng)24h后收集上清液備用。其中，細(xì)胞培養(yǎng)所用FBS采用超速離心法(100000×g，12h)去除EXOs后經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

3.SCs來源 EXOs的提?。篠Cs分組培養(yǎng)24h后取細(xì)胞上清液，按照300×g離心10min、2000×g離心10min、10000×g離心30min的步驟棄沉淀收集上清液，采用超速離心法100000×g離心70min，沉淀用PBS重懸浮后100000×g離心70min，沉淀部分即為EXOs。

4. DRGn培養(yǎng)及分組：采用雙酶消化法分離培養(yǎng)DRGn。取5～7天的新生SD乳鼠，處死后于體視鏡下取椎間孔內(nèi)DRGn，放入雙酶消化體系(胰酶∶膠原酶=5∶1)中于37℃水浴孵育1h，離心后將DRGn接種于培養(yǎng)皿中。模型組DRGn均給予50mmol/L葡萄糖。將DRGn分為6組，即空白對(duì)照組(DRGn完全培養(yǎng)基)、模型+空白外泌體組(模型組DRGn+空白對(duì)照組SCs EXOs)、模型組(模型組DRGn+模型對(duì)照組SCs EXOs)、PF1低劑量組(模型組DRGn+PF低劑量組SCs EXOs)、PF10中劑量組(模型組DRGn+PF中劑量組SCs EXOs)和PF100高劑量組(模型組DRGn+PF高劑量組SCs EXOs)，培養(yǎng)24h后檢測相關(guān)指標(biāo)變化。

5.SCs來源 EXOs的形態(tài)觀察：取超速離心法提取的EXOs，加入戊二醛于 4℃保存，送至首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測試中心形態(tài)學(xué)研究測試室制備電鏡樣本，使用Hitachi7700透射電子顯微鏡觀察EXOs形態(tài)。

6.SCs來源EXOs的內(nèi)化實(shí)驗(yàn)：取EXOs與2μl PKH26染料，分別加入0.25ml Diluent C中，將二者合并混勻后常溫避光孵育4min?；旌弦恨D(zhuǎn)移到離心管中，加入完全培養(yǎng)基中止染色，100000×g離心70min清除多余染料，沉淀部分即為標(biāo)記完成的EXOs。將DRGn接種到腔室載玻片中，加入標(biāo)記后的EXOs培養(yǎng)18h后，4%多聚甲醛固定 10min，進(jìn)行DAPI細(xì)胞核染色、封片后采用激光共聚焦法觀察EXOs內(nèi)化情況。

7.Western blot法檢測蛋白表達(dá)：(1)取SCs來源EXOs，BCA法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫孵育1h后用CD63抗體(稀釋度均為1∶2000)Nrf2與HO-1抗體(稀釋度為1∶500)4℃孵育過夜。次日用二抗室溫孵育1h后，加入ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影。應(yīng)用Image J軟件針對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，獲得灰度值以反映蛋白含量。(2)收集分組培養(yǎng)24h后的DRGn，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后檢測DRGn中GADD153、Bcl-2、Bax(稀釋度為1∶500)的表達(dá)。應(yīng)用Image J進(jìn)行分析獲得灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)蛋白含量。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析前檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E)描述。多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，方差齊性(equal variances assumed)條件下，選擇最小顯著性差異(least significant difference，LSD)分析，方差不齊性(equal variances not assumed)條件下，選擇Tambane′sT2 分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.SCs來源EXOs的鑒定：透射電鏡法觀察SCs來源EXOs的形態(tài)，如圖1A所示，觀察到EXOs直徑定位在30～100nm，呈圓形囊泡狀，具有雙層膜結(jié)構(gòu)。Western blot法檢測結(jié)果表明(圖1B)，外泌體標(biāo)志蛋白CD63在空白對(duì)照組以及模型對(duì)照組中均有表達(dá)，模型對(duì)照組蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 SCs來源EXOs的鑒定A.透射電鏡法觀察外泌體形態(tài)(×40000)；黃色箭頭指向EXOs的雙層膜狀結(jié)構(gòu)；B.外泌體表面特異性蛋白的表達(dá)。n=4

2.SCs來源EXOs中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，PF各組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，PF10中劑量組、PF100高劑量組Nrf2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，PF1低劑量組、PF10中劑量組的HO-1蛋白表達(dá)升高(P<0.01，n=4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PF能增加高糖環(huán)境下SCs來源 EXOs中抗氧化應(yīng)激蛋白Nrf2以及HO-1的表達(dá)(圖2)。

圖2 SCs來源EXOs中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平A.Western blot法檢測圖像；B.蛋白表達(dá)水平， n=4，與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較,#P<0.01

3.SCs來源EXOs的內(nèi)化實(shí)驗(yàn)：SCs分泌EXOs作用于受體DRGn。激光共聚焦顯微鏡下，觀察到綠色部分為DRGn細(xì)胞骨架，SCs來源EXOs被PKH26標(biāo)記呈現(xiàn)紅色熒光，位于DRGn細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，分布于藍(lán)色的DRGn細(xì)胞核周圍，證明DRGn能夠攝取SCs來源EXOs。

4.各組EXOs干預(yù)后 DRGn中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組促凋亡蛋白GADD153和Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，PF各劑量組促凋亡蛋白GADD153和Bax顯著降低(P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖3 DRGn內(nèi)化SCs來源EXOs(×1000)A.β-tubulin染色；B.DAPI染色；C.PKH26染色；D.合并后圖像

圖4 DRGn中GADD153、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平A.Western blot圖像；B.蛋白表達(dá)水平， n=4。與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型對(duì)照組比較,#P<0.01

討 論

EXOs是一種分子直徑為40～100nm的亞細(xì)胞雙層膜囊泡[6]。EXOs表面的四跨膜蛋白超家族如CD9、CD63和CD81，常作為EXOs的特異性標(biāo)志物。EXOs既可以通過質(zhì)膜受體直接激活受體細(xì)胞，也可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA甚至細(xì)胞器進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)通過攜帶處于不同病理狀態(tài)下的細(xì)胞所含有的特異性物質(zhì)，從而在生理學(xué)和病理學(xué)上都發(fā)揮著重要作用[7,8]。EXOs介導(dǎo)的細(xì)胞間交流主要有3種形式，即表面信號(hào)分子的直接作用、膜融合時(shí)RNAs的直接調(diào)節(jié)以及生物活性成分的細(xì)胞外釋放[9]。本實(shí)驗(yàn)中SCs釋放到培養(yǎng)基中的EXOs含有Nrf2、HO-1。從差速離心技術(shù)獲取的EXOs，采用Western blot法對(duì)EXOs特異性標(biāo)志蛋白CD63進(jìn)行驗(yàn)證，證實(shí)了從SCs培養(yǎng)上清中分離得到的EXOs特異性，高糖環(huán)境下比空白對(duì)照組EXOs分泌更多的CD63。電子顯微鏡觀察到囊泡的直徑呈40～100nm和雙層膜結(jié)構(gòu)，證實(shí)了分離的EXOs的大小范圍和形態(tài)。

SCs可以通過分泌EXOs影響DRG的軸突生長[10]。糖尿病長期的高糖環(huán)境可以改變SCs來源EXOs內(nèi)物質(zhì)組成，被DRGn攝取后發(fā)生神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[11，12]。受體細(xì)胞攝取EXOs可通過內(nèi)吞作用、簡單融合和EXOs表面配體作用[13]。EXOs攜帶的貨物分子直接影響受體細(xì)胞功能[14]。有研究表明DRGn的軸突內(nèi)化SCs來源于EXOs，促進(jìn)其在損傷后的再生[15]。DRGn細(xì)胞凋亡與缺失是DPN發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[10]。SCs與DRGn密切相關(guān)，SCs來源的EXOs可以被周圍神經(jīng)軸突內(nèi)化，促進(jìn)神經(jīng)生長，而高糖環(huán)境下SCs分泌的EXOs，攜帶氧化應(yīng)激信息，內(nèi)化入DRGn，影響了DRGn的軸突生長[16]。

氧化應(yīng)激是DPN的主要發(fā)病機(jī)制，持續(xù)的高糖刺激產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，損傷抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生[17]。Nrf2能夠通過調(diào)節(jié)多種抗氧化蛋白、解毒酶和外源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的重要防御性傳導(dǎo)蛋白[18]。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，Nrf2被絲氨酸激酶磷酸化，引起Keapl和Nrf2解離，Nrf2激活進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游基因血紅素單加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)的表達(dá)，抵抗ROS對(duì)細(xì)胞的侵害[19]。ROS的堆積導(dǎo)致抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路受到抑制，刺激Bax流入線粒體，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)直接激活半胱氨酸蛋白酶家族蛋白caspase-3表達(dá)，引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[20]。

PF為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)或川赤芍(P.veitchiiLynch)的主要有效成分和指標(biāo)性成分[21]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，PF能夠抗自由基損傷。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，PF能夠明顯減弱H2O2對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度和線粒體跨膜電位的影響，從而減輕細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，PF干預(yù)SCs分泌的EXOs，攜帶抗氧化應(yīng)激防御分子Nrf2、HO-1，通過受體細(xì)胞DRGn內(nèi)化，影響高糖環(huán)境下DRGn凋亡蛋白的表達(dá)，降低DRGn中促凋亡蛋白GADD153和Bax的表達(dá)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，從而豐富其細(xì)胞防御機(jī)制，以減輕自身的氧化應(yīng)激狀態(tài)所致的細(xì)胞損傷，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，保護(hù)DRGn，改善DPN。