miR-29a通過調(diào)控DNMT3b對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期、凋亡及P16甲基化的影響

白志興 (青海紅十字醫(yī)院婦產(chǎn)科，青海 西寧 810000)

宮頸癌是常見婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居生殖系統(tǒng)腫瘤首位，且近年來發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)〔1〕。目前對(duì)于宮頸癌的治療手段主要為根治性手術(shù)和放化療，治療過程中的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔2〕。因此，研究宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)于尋找治療宮頸癌的基因靶點(diǎn)十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，癌基因區(qū)啟動(dòng)子異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔3〕。微小RNA(miR)可通過與靶基因3′-UTR區(qū)結(jié)合參與機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡等生理過程〔4〕。研究表明，miR-29a在非小細(xì)胞肺癌〔5〕、宮頸癌〔6〕等惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，在前列腺癌疾病中可調(diào)控去甲基化基因表達(dá)發(fā)揮抑癌作用〔7〕。通過在線軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)3b是miR-29a的靶基因。本研究通過檢測(cè)宮頸癌組織中miR-29a表達(dá)，并分析其對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期、凋亡及P16甲基化的影響，為宮頸癌防治尋求有效的干預(yù)靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞、HcerEpic人正常子宮頸上皮細(xì)胞，Hela、SiHa、MS751人宮頸癌細(xì)胞系均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。主要試劑與儀器： miR-29a mimics及陰性對(duì)照mimics-NC購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司； miR-29a 與內(nèi)參基因U6基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；葡萄糖、胎牛血清、二甲基亞砜、DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒、MTS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)sigma公司；蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司；LipofectamineTM3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Anti-DNMT3b、Anti-GAPDH均購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司。 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本sanyo公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司；普通光學(xué)顯微鏡，購(gòu)自美國(guó)Olympus 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇后的HcerEpic人正常子宮頸上皮細(xì)胞、Hela、SiHa、MS751人宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)(100 mg/L鏈霉素，100 kU/L青霉素)，37℃，5% CO2培養(yǎng)，2～3 h后收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-29a相對(duì)表達(dá)量。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后接種于6孔細(xì)胞板(1×106個(gè)/孔)，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分組：miR-29a過表達(dá)組(mimics)組，轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L，miR-29a mimics序列為5′-GTGGAGGGTCCGAGGT-3′；miR-29a陰性對(duì)照(NC)組，轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L，miR-29a mimics-NC序列為5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTAA-3′；空白對(duì)照組(BC)不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，篩選出穩(wěn)定表達(dá)miR-29a細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞檢測(cè)。qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-29a相對(duì)表達(dá)量。

1.3CKK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將穩(wěn)定表達(dá)miR-29a的細(xì)胞接種至96孔板(5.0×104個(gè)/孔)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0、12、24、36、48、60、72 h后，按照說明書操作，加入CKK-8試劑，酶標(biāo)儀(450 nm)檢測(cè)細(xì)胞光密度(OD)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，經(jīng)離心后收集、洗滌，加入annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)溶液，4℃避光孵育10 min后，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。FITC+/PI-為凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC-/PI-為活細(xì)胞，F(xiàn)ITC+/PI+為壞死細(xì)胞，F(xiàn)ITC-/PI+為機(jī)械損傷壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。其中，第1象限為機(jī)械性損傷細(xì)胞，第2象限為壞死細(xì)胞，第3象限為活細(xì)胞，第4象限為凋亡細(xì)胞。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，經(jīng)離心后收集、洗滌，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，加入無水乙醇達(dá)到中濃度70%，固定細(xì)胞，4℃過夜，離心、洗滌后，PBS重懸，4℃避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，計(jì)算各組細(xì)胞G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞所占百分比。

1.6甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)細(xì)胞P16基因CpG島甲基化狀態(tài) 提取DNA，變性、純化后，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行MSP-PCR，檢測(cè)P16基因甲基化情況。MSP擴(kuò)增后，甲基化：出現(xiàn)甲基化條帶，無非甲基化條帶；非甲基化：出現(xiàn)非甲基化條帶，無甲基化條帶；半甲基化：同時(shí)出現(xiàn)甲基化和非甲基化條帶。

1.7Western印跡檢測(cè)DNMT3b、p16 蛋白表達(dá) 收集1.2轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)miR-29a的細(xì)胞，提取總蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白總量，利用Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNMT3b蛋白水平。

1.8熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-29a對(duì)DNMT3b的調(diào)控 在線軟件TargetScan顯示人miR-29a可能與DNMT3b基因3′UTR區(qū)域結(jié)合，對(duì)含有該結(jié)合位點(diǎn)的DNMT3b基因3′UTR進(jìn)行擴(kuò)增，連到PGEM-T載體上，測(cè)序篩選，酶切連接至pGL4熒光素酶報(bào)告載體，構(gòu)建野生型p-GL4-DNMT3b-wt和突變型p-GL4-DNMT3b-mut報(bào)告基因質(zhì)粒。取1.2培養(yǎng)細(xì)胞于48孔板，24 h細(xì)胞貼壁后，將miR-29a mimics、miR-29a mimics-NC與pGL4、含熒光素酶報(bào)告基因p-GL4-DNMT3b-wt、p-GL4-DNMT3b-mut共轉(zhuǎn)染，24 h后，PBS漂洗，加入Passive lysis buffer裂解后，加入96孔板，在GloMax檢測(cè)儀檢測(cè)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-29a在子宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá) 子宮頸癌細(xì)胞SiHa(0.61±0.07)、Hela(0.53±0.04)、MSP175(0.69±0.08)中miR-29a的相對(duì)表達(dá)水平均較正常宮頸細(xì)胞HcerEpic(1.05±0.15)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-29a在 mimics轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞后相對(duì)表達(dá)量 miR-29a mimics轉(zhuǎn)染后，mimics組(13.25±0.86)Hela細(xì)胞中miR-29a的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于NC組(0.98±0.03)和BC組(0.96±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡情況 mimics組(15.85±0.38)Hela細(xì)胞凋亡率較NC組(0.87±0.03)和BC組(0.85±0.02)顯著升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡情況比較

2.4Hela細(xì)胞周期變化 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，mimics組G0/G1期細(xì)胞比例較NC組和BC組顯著升高(P<0.05)；3組S期及G2/M期細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2，表1。

圖2 Hela細(xì)胞周期變化

表1 3組細(xì)胞周期比較

2.5MSP法檢測(cè)細(xì)胞P16基因CpG島甲基化狀態(tài) mimics組Hela細(xì)胞P16基因CpG島甲基化率顯著低于NC組和BC組(P<0.05)。見圖3。

U：非甲基化；M甲基化圖3 MSP法檢測(cè)細(xì)胞P16基因CpG島甲基化

2.6Western印跡檢測(cè)DNMT3b、p16 蛋白表達(dá) mimics組Hela細(xì)胞中DNMT3b蛋白表達(dá)量顯著低于NC組和BC組(P<0.05)，p16 蛋白表達(dá)量顯著高于NC組和BC組(P<0.05)。見圖4，表2。

圖4 Western印跡檢測(cè)DNMT3b、p16 蛋白表達(dá)

表2 3組DNMT3b、p16 蛋白表達(dá)

2.7熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-29a對(duì)DNMT3b的調(diào)控 miR-29a mimics+p-GL4組熒光素酶活性強(qiáng)度(1.05±0.06)與miR-29a NC+p-GL4組(1.09±0.06)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；miR-29a mimics+p-GL4-DNMT3b-wt組熒光素酶活性強(qiáng)度(0.42±0.01)較miR-29a NC+p-GL4-DNMT3b-wt組(0.92±0.04)顯著降低(P<0.05)；miR-29a mimics+p-GL4-DNMT3b-mut組熒光素酶活性強(qiáng)度(0.85±0.02)與miR-29a NC+p-GL4-DNMT3b-mut組(0.87±0.03)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

miR通過參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miR-29a在前列腺癌〔7〕、宮頸癌〔6〕腫瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)水平降低。Hayes等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-29a可顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。過表達(dá)miR-29a可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移，提示miR-29a低表達(dá)可能參與乳腺癌腫瘤的發(fā)生與發(fā)展〔9〕。miR-29a在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，通過多種途徑發(fā)揮抗癌作用。Hela細(xì)胞中，miR-29a表達(dá)水平與抗癌基因p53活性負(fù)相關(guān)，過表達(dá)miR-29a可誘導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染效果較好，提示過表達(dá)miR-29a可顯著抑制Hela細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-29a可使細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。抑癌基因啟動(dòng)區(qū)CpG島高甲基化可能與宮頸癌發(fā)生有關(guān)〔11〕。P16基因在胃癌〔12〕、肝癌〔13〕等腫瘤中作為抑癌基因發(fā)揮作用，被稱為腫瘤抑制基因，其功能產(chǎn)物P16蛋白可負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，P16基因失活則會(huì)引起細(xì)胞增殖失控。在宮頸癌中，P16基因主要失活形式為CpG島甲基化。宮頸癌腫瘤細(xì)胞P16 CpG島甲基化發(fā)生率較宮頸炎組織細(xì)胞顯著升高〔14〕。多個(gè)研究顯示，DNMT3b表達(dá)水平升高與CpG島高甲基化正相關(guān)，DNMT3b可通過促進(jìn)DNA高甲基化參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展〔15,16〕。本研究結(jié)果提示過表達(dá)miR-29a可提高Hela細(xì)胞p16 蛋白水平。進(jìn)一步研究提示過表達(dá)miR-29a可顯著減少P16 CpG島甲基化。

利用在線軟件TargetScan對(duì)miR-29a靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNMT3b是miR-29a靶基因。DNMT3b是機(jī)體內(nèi)重要的從頭甲基化酶，可將DNA鏈中的C5胞嘧啶甲基化。DNA甲基化可沉默基因表達(dá)，而去甲基化則激活基因表達(dá)。DNMT在基因甲基化中發(fā)揮作用。研究表明，DNMT3b在膀胱癌〔17〕、肝癌〔18〕、乳腺癌〔19〕等多種腫瘤中表達(dá)水平升高。因此干擾DNMT3b蛋白表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞DNA的甲基化狀態(tài)，已成為新的癌癥靶向治療研究熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA干擾DNMT3b表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移，且能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡〔20〕。另有研究表明，在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-29a可抑制DNMT3b mRNA及蛋白表達(dá)，從而重新激活因DNA甲基化而沉默的抑癌基因，抑制腫瘤生長(zhǎng)，發(fā)揮抗癌作用〔21〕。本研究結(jié)果提示過表達(dá)miR-29a可能抑制DNMT3b表達(dá)。進(jìn)一步研究提示miR-29a可靶向調(diào)控DNMT3b基因表達(dá)，過表達(dá)miR-29a可抑制DNMT3b基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。