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    Gαi1/3對術(shù)后認(rèn)知功能障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

    2020-12-24 11:25:28張玉鳳張浩孫劍淮安市婦幼保健院麻醉科江蘇淮安223002
    中國老年學(xué)雜志 2020年24期
    關(guān)鍵詞:所在位置氟烷海馬

    張玉鳳 張浩 孫劍 (淮安市婦幼保健院麻醉科,江蘇 淮安 223002)

    術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是患者手術(shù)麻醉后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為麻醉后患者記憶力,抽象思維及定向力障礙,并伴有社會活動能力減退,即人格、社交能力和認(rèn)知能力的改變〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)血清神經(jīng)生長因子(NGF)水平與全麻手術(shù)患者POCD有關(guān),有學(xué)者發(fā)現(xiàn)七氟烷能夠降低宮頸癌及前列腺增生患者血清NGF水平,并對術(shù)后1 d認(rèn)知功能造成一定影響〔2,3〕,丙泊酚麻醉同樣影響患者術(shù)后血清NGF水平及簡易智能狀態(tài)檢查量表評分〔4〕,這些研究均提示早期監(jiān)測血清NGF水平有利于預(yù)測POCD的發(fā)生,而外源性給予NGF可顯著影響腦神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展〔5,6〕,但具體分子機制尚不明確。

    NGF與高親和力受體酪氨酸基酶(Trk)A結(jié)合后能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞下游炎癥反應(yīng)通路的激活〔7,8〕,可能是緩解POCD發(fā)展的重要機制。研究發(fā)現(xiàn)在表皮生長因子(EGF)和角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)與受體結(jié)合后均會通過Gαi1/3激活招募Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白(Gab 1),具體機制主要是受體、Gαi1/3、Gab1形成復(fù)合物,從而介導(dǎo)下游信號通路的激活〔9,10〕。EGF受體(R)和KGFR都是具備酪氨酸激酶活性的細(xì)胞表面受體,與TrkA相似。因此猜測Gαi1/3同樣能與TrkA受體及信號下游的Gab1結(jié)合,從而影響NGF的功能發(fā)揮,損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本文運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制Gαi1/3的表達(dá),觀察其對小鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,同時用避暗實驗及水迷宮實驗記錄小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

    1 材料與方法

    1.1實驗動物與分組 清潔級健康C57/B6小鼠75只,6~7月齡,體重26~32 g,由揚州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。采用隨機數(shù)字表法分為5組(n=15):C 組、P組,P1組、P2組和P3組。除C組外其余4組采取異氟烷吸入建立POCD模型。海馬區(qū)立體定位注射P組慢病毒空載體,P1組慢病毒包裹的 Gαi1-shRNA,P2組慢病毒包裹的 Gαi3-shRNA,P3組慢病毒包裹的 Gαi1/3-shRNA,C組不進(jìn)行藥物及手術(shù)干預(yù)。

    1.2小鼠POCD模型制備〔11〕采用異氟烷吸入制備小鼠 POCD 模型,選取成年 C57/B6 小鼠,經(jīng)7 d適應(yīng)環(huán)境后,持續(xù)吸入 1.5%異氟烷4 h,術(shù)后注意保暖待小鼠麻醉恢復(fù)翻正反射后放回籠子里各自飼養(yǎng)。

    1.3避暗試驗 避暗試驗分為訓(xùn)練和正式試驗兩個階段:訓(xùn)練前將小鼠頭背著洞口放入明室,先適應(yīng)環(huán)境 3 min,然后給暗室銅柵通以36 V電流,小鼠一進(jìn)入暗室即受電擊,其正確反應(yīng)是回到明室,銅柵通電持續(xù) 5 min,此為訓(xùn)練過程。24 h后對小鼠進(jìn)行記憶測驗,記錄小鼠第一次進(jìn)入暗室的時間,此為避暗潛伏期。

    1.4Morris 水迷宮試驗 被動避暗試驗結(jié)束后,開始Morris水迷宮試驗,分為訓(xùn)練期、定向航行試驗和空間搜索試驗三部分進(jìn)行。訓(xùn)練期:在定向航行試驗前1 d,水池中不放置平臺,使小鼠在水中自由游泳 2 min,使其適應(yīng)環(huán)境。定向航行試驗:進(jìn)行定向航行試驗時,將平臺放在固定的第二象限。該試驗訓(xùn)練小鼠每天 4 次,共5 d。訓(xùn)練時,將小鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池,記錄鼠入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間,作為潛伏期,并記錄從小鼠入水至找到平臺通過路徑的總長度。小鼠找到平臺后,讓其在平臺上站立30 s。若入水后60 s若小鼠仍未能找到平臺,則將其輕輕從水中引導(dǎo)拖上平臺,并停留30 s,然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每只鼠從4個入水點分別放入水池為1次訓(xùn)練,兩次訓(xùn)練間隔2 min??臻g搜索試驗: 在定向航行試驗結(jié)束后,即第6天,將平臺撤去,使其在水中尋找原平臺所在位置,共120 s,記錄從小鼠第1次到達(dá)平臺原來所在位置的時間,及穿越原平臺的次數(shù),來評價小鼠記憶重現(xiàn)的能力。

    1.5Western印跡法檢測海馬區(qū)Gαi1、Gαi3蛋白表達(dá)水平 行為學(xué)實驗結(jié)束后處死小鼠并取海馬組織,加入預(yù)冷的放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液及0.1%的PMSF,冰上勻漿。勻漿后離心提取上清液,即海馬組織總蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)法測定各樣品總蛋白濃度,以最低蛋白濃度為標(biāo)準(zhǔn)配成等濃度等體積的蛋白樣品。以樣本體積的1/4為標(biāo)準(zhǔn)加入5×蛋白上樣緩沖液,搖勻后沸水煮10 min,-20℃保存待用。用濕式電轉(zhuǎn)儀法,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入一抗Gαi1、Gαi3,4℃孵育過夜。第二天加二抗,室溫孵育2 h,TBST洗10 min,重復(fù)3次,用堿性磷酸酯酶試劑盒顯色,待晾干后掃描條帶,采用Image J圖像軟件分析各蛋白條帶的灰度值,以目的蛋白與Tubulin灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

    1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,重復(fù)測量方差分析。

    2 結(jié) 果

    2.1小鼠海馬區(qū)Gαi1和Gαi3蛋白表達(dá) 與C組和P組比較,P1組海馬區(qū)Gαi1蛋白表達(dá)水平顯著下降,P2組海馬區(qū)Gαi3蛋白表達(dá)水平顯著下降,P3組海馬區(qū)Gαi1和Gαi3蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。見圖1。

    圖1 各組海馬組織Gαi3和Gαi3蛋白表達(dá)

    2.2避暗實驗結(jié)果 與C組比較,其他4組避暗潛伏期顯著縮短(P<0.05);與P組比較,P1組和P2組避暗潛伏期無明顯變化(P>0.05),而P3組避暗潛伏期顯著縮短(P<0.05)。見表1。

    2.3定位航行實驗 與C組比較,第3天及以后其他四組潛伏期顯著延長(P<0.05);與P組比較,P1組和P2組潛伏期無明顯變化(P>0.05),而第4、5天P3組潛伏期顯著延長(P<0.05)。見表1。

    表1 各組避暗實驗及Morris水迷宮定位航行結(jié)果比較

    2.4空間探索實驗 與C組比較,其他四組第1次到達(dá)原平臺所在位置時間顯著延長,穿越原平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05);與P組比較,P1組和P2組第1次到達(dá)原平臺所在位置時間及穿越原平臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05),而P3組第1次到達(dá)原平臺所在位置時間顯著延長,穿越原平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05)。見表2。

    表2 Morris 水迷宮空間探索實驗結(jié)果

    3 討 論

    G蛋白又稱鳥嘌呤核苷酸蛋白,由α、β和γ亞單位構(gòu)成的異源三聚體。G蛋白根據(jù)α亞單位功能命名包括Gαs、Gαi、Gαq、Gα12,其中Gαi是成員最多的一種G蛋白〔12〕。Gαi又分為Gαi1、Gαi2、Gαi3、GαiO和Gαit等〔13〕。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為 Gαi 蛋白只和 G 蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合〔14,15〕。而最近研究發(fā)現(xiàn)Gαi 蛋白通過耦聯(lián)并激活下游接頭蛋白 Gab1介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)-TrkB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)〔16〕。NGF與BDNF同屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子,是神經(jīng)系統(tǒng)重要的生長因子。NGF 主要有兩種膜表面受體,即TrkA和神經(jīng)營養(yǎng)素受體 p75(p75)。TrkA 識別并結(jié)合 NGF 后,發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞存活、增殖和分化的作用〔17〕。本研究說明Gαi1和Gαi3在NGF-TrkA信號通路中可能發(fā)揮著相似或相同的生物學(xué)效應(yīng)。

    綜上,同時抑制海馬區(qū)Gαi1和Gαi3蛋白表達(dá)可以加重POCD小鼠認(rèn)知功能障礙,而單獨抑制Gαi1或Gαi3對POCD小鼠認(rèn)知功能無明顯改變。

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