流式細(xì)胞儀在本科生“分子生物學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用與實(shí)踐

牛熙 李升 齊芬芳

[摘 要]為了能夠讓本科“分子生物學(xué)”實(shí)驗(yàn)課程更為新穎和豐富，提高大型儀器流式細(xì)胞儀的使用效率，根據(jù)分子生物學(xué)課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)，結(jié)合理論教學(xué)的同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中使用流式細(xì)胞儀開展細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)。通過實(shí)驗(yàn)課的開展，鍛煉學(xué)生基本實(shí)驗(yàn)技能，為今后科研工作打下良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]流式細(xì)胞儀;分子生物學(xué);實(shí)驗(yàn)課程

[基金項(xiàng)目]2019年貴州大學(xué)本科教學(xué)工程建設(shè)項(xiàng)目“貴州大學(xué)分子生物學(xué)課程本科教學(xué)工程建設(shè)項(xiàng)目”（JG201977）;2018年貴州大學(xué)培育項(xiàng)目“香豬卵巢繁殖力相關(guān)lncRNA的鑒定與生物學(xué)功能分析”（黔科合平臺人才〔2018〕5781-40號）;2015年貴州科技廳與貴州大學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目“PDIA4基因多態(tài)性與香豬產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)研究”（黔科合LH字〔2015〕7673）

[作者簡介]牛 熙（1987—），女，貴州貴陽人，碩士，在讀博士，貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯游锓肿由飳W(xué);齊芬芳（1986—），女，湖南株洲人，碩士，貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院博士研究生，遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校講師（通信作者），研究方向?yàn)槲⑸锛皠游锓肿由飳W(xué)。

[中圖分類號] G642.0[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1674-9324（2020）45-0-03[收稿日期] 2020-05-14

20世紀(jì)50年代以來，以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)作為生物學(xué)的前沿學(xué)科，其實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)內(nèi)容就十分重要。[1-3]以貴州大學(xué)為例，目前本科生雖然開展的分子生物學(xué)課程，但仍以一些基本的實(shí)驗(yàn)操作為主，如動物基因組DNA提取，PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、目的片段膠回收、大腸桿菌感受態(tài)的制備、目的基因連接與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、植物葉片RNA的提取等，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目較為簡單，造成本科生科研經(jīng)驗(yàn)和科研能力不足等問題。高校大型精密儀器作為提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量、培養(yǎng)高素質(zhì)人才，提高科研水平的重要保障條件[4-6]，在本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)中增加大型精密儀器的使用，可讓本科生在掌握基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的同時(shí)，為今后的科研提供較好的學(xué)習(xí)平臺。目前為了提升本科生的科研技能，貴州大學(xué)雖然開展了本科SRT項(xiàng)目設(shè)計(jì)、大學(xué)生創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備管理處開放項(xiàng)目[7]，但只受益于部分本科生，大型精密儀器在本科實(shí)驗(yàn)中尚未普及。

流式細(xì)胞儀（flow cytometer，F(xiàn)CM）作為大型精密儀器，能對處在直線、快速、流動狀態(tài)中的單個(gè)細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行分析及精確分選，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域[8-11]。因此，在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中加入流式細(xì)胞儀的掌握，除了能夠提高大型精密儀器的使用效率，同時(shí)讓更多的本科生能夠有機(jī)會熟悉和掌握大型精密儀器的原理、方法和操作，提升學(xué)生的科研競爭力。

目前貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院通過建設(shè)，已擁有了能夠面向校內(nèi)外科研人員的生物科學(xué)大型儀器共享平臺[12]。目前該平臺主要開展了對外分析測試服務(wù)，針對生物學(xué)學(xué)科教學(xué)主要是以參觀教學(xué)為主。我院流式細(xì)胞儀型號為BDFACS Aria Ⅱ（分析/分選型），除用于藥學(xué)相關(guān)研究外，還在本校的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備管理處開放項(xiàng)目資助下，結(jié)合理論課向部分本科生開放細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期以及黏蛋白13（mucin13，MUC13）與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4ac型的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。為了能夠讓更多的本科生了解流式細(xì)胞術(shù)，計(jì)劃在本科生“分子生物學(xué)”課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中增加相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

一、流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和工作原理

流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)主要包括以下幾個(gè)部分：（1）光學(xué)系統(tǒng)。由于流式細(xì)胞儀器主要是通過對光信號的采集和檢測來對樣品進(jìn)行分析的，因此光學(xué)系統(tǒng)在流式細(xì)胞儀中有著最為重要的作用。它由激發(fā)光源和若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學(xué)元件組成。（2）電子系統(tǒng)。電子系統(tǒng)作為流式細(xì)胞儀的大腦，主要負(fù)責(zé)將探測器產(chǎn)生的光電流信號進(jìn)行數(shù)字化，處理信號并儲存相關(guān)數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。該系統(tǒng)主要由光電轉(zhuǎn)換器件、放大器和信號處理電路組成。（3）液流系統(tǒng)。該系統(tǒng)是由鞘液系統(tǒng)和樣品流動系統(tǒng)組成，主要負(fù)責(zé)將測試樣本從樣品管轉(zhuǎn)移至流動室，在鞘液的作用下，得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息，然后樣品被分選出來（在細(xì)胞分選儀中）或移到廢液中。（4）數(shù)據(jù)系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)系統(tǒng)主要是通過計(jì)算機(jī)以及分析軟件保障儀器運(yùn)行、數(shù)據(jù)的采集和分析。除上述固定基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)外，具有分選功能的流式細(xì)胞儀還包括分選系統(tǒng)，該系統(tǒng)能根據(jù)某類細(xì)胞的特性，給這類細(xì)胞的液滴充以特定電荷，帶電荷的液滴進(jìn)入偏轉(zhuǎn)板靜電場時(shí)發(fā)生向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入固定的收集器內(nèi)，不帶電的液滴則直接進(jìn)入到廢液槽中，從而達(dá)到獲得特定細(xì)胞的目的[13-15]。

二、實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

以敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響為研究對象，結(jié)合學(xué)校實(shí)際情況、實(shí)驗(yàn)運(yùn)行成本及操作難度、時(shí)間等因素，計(jì)劃在本科生《分子生物學(xué)》課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展細(xì)胞凋亡檢測和細(xì)胞周期檢測2個(gè)實(shí)驗(yàn)。

流式細(xì)胞儀的教學(xué)可分成理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)操作兩個(gè)部分。理論教學(xué)部分主要以教師集中授課方式進(jìn)行，教學(xué)內(nèi)容主要分為三個(gè)部分：（1）課堂講授流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展簡史及流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)和工作原理;（2）采取儀器現(xiàn)場觀摩、學(xué)生分組輪換的形式向?qū)W生闡述待測標(biāo)本經(jīng)過儀器的各結(jié)構(gòu)的情況，將流式細(xì)胞儀的檢測原理拓展并貫穿至儀器的各個(gè)結(jié)構(gòu)中，使學(xué)生對流式細(xì)胞儀有個(gè)比較清晰的認(rèn)識;（3）根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)向?qū)W生講授細(xì)胞凋亡檢測和細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn)的原理、方法、步驟、注意事項(xiàng)及考查方式等[13]。實(shí)驗(yàn)操作部分則以學(xué)生自主學(xué)習(xí)為主：首先在保障儀器對外服務(wù)的同時(shí)，采取現(xiàn)場教學(xué)的方式對學(xué)生進(jìn)行儀器使用培訓(xùn);然后根據(jù)儀器使用情況及班級人數(shù)，按照分組進(jìn)行細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測;最后分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告[6]。

三、實(shí)驗(yàn)實(shí)操部分課程設(shè)計(jì)

（一）儀器使用培訓(xùn)

儀器使用培訓(xùn)的教學(xué)內(nèi)容主要包括4個(gè)方面：（1）演示開機(jī)程序：首先確認(rèn)是否需要添加鞘液及傾倒廢液;然后逐一打開穩(wěn)壓電源、計(jì)算機(jī)、儀器主開關(guān)、激光光源控制器、控制軟件;最后強(qiáng)調(diào)開機(jī)過程中的注意事項(xiàng)。（2）運(yùn)行儀器控制軟件，講解軟件的構(gòu)成和使用。（3）利用BD公司培訓(xùn)用熒光微球，用單色和雙色實(shí)驗(yàn)演示細(xì)胞凋亡（Annexin V-FITC/PI雙色）及細(xì)胞周期（PI單色）的分析檢測方法。（4）演示關(guān)機(jī)程序及強(qiáng)調(diào)日常維護(hù)的注意事項(xiàng)。

（二）實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)

1.實(shí)驗(yàn)一：敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡的影響。制備293T人腎細(xì)胞懸液（1×106cells/mL）。向12孔細(xì)胞培養(yǎng)板板中加入1mL細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)至貼壁（5%CO2、37℃）后，加入含有不同濃度敵敵畏（可由學(xué)生自行設(shè)計(jì)）的培養(yǎng)液處理1h。用胰蛋白酶消化細(xì)胞后收集于1.5mL的離心管中，低速短時(shí)離心后（1000r/min離心3min），加入PH7.5的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2～3次。將清洗后的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液（1～5×106 cells/mL），根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入適量的Binding Buffer懸浮細(xì)胞（100～500μL）。根據(jù)試劑盒說明書，向制好的懸浮細(xì)胞中加入適量Annexin V-FITC混勻后，再加入適量Propidium Iodide（PI）混勻，反應(yīng)5～15min（室溫避光）。所有樣品必須在1h內(nèi)進(jìn)行檢測[16，17]。

2.實(shí)驗(yàn)二：敵敵畏對人腎細(xì)胞周期的影響。取293T人腎細(xì)胞（濃度：1×106cells/mL;狀態(tài)：對數(shù)生長期）接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在5%CO2、37℃的條件下培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后，向293T人腎細(xì)胞加入含有不同濃度敵敵畏（可由學(xué)生自行設(shè)計(jì)）的培養(yǎng)液。1h后，用胰蛋白酶處理并收集細(xì)胞。用PBS處理細(xì)胞后（2～3次），制成適當(dāng)濃度的單細(xì)胞懸液。取3mL單細(xì)胞懸液，1000r/min離心3min，去除上清液后，逐滴加入預(yù)冷的無水乙醇1.5ml（乙醇終濃度為75%），-20℃固定過夜。取出固定后的樣品，低速離心去除上清液。用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞后，低速離心收集細(xì)胞。加入RNaseA 150μL重懸細(xì)胞（需用PBS稀釋，濃度為250～500ug/ml）。最后加入150μL PI工作液，4℃避光染色30min，上機(jī)檢測[16]。

（三）結(jié)果與分析

1.實(shí)驗(yàn)一：敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡的影響。在正常人腎細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PhosphatidyISerine，PS）通常只分散在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，經(jīng)過不同濃度敵敵畏處理后，人腎細(xì)胞就會發(fā)生不同程度凋亡。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，細(xì)胞膜中的PS會由細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白（分子量為35～36kD），能特異性結(jié)合PS，故可利用用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記后的Annexin V鑒別出發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）作為一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，而在中晚期凋亡細(xì)胞或者死亡細(xì)胞中，細(xì)胞核能被透過細(xì)胞膜的PI染紅。因此通常在細(xì)胞凋亡試劑盒中，使用Annexin V與PI來檢測處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞[11，12]。實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析均有學(xué)生自己獨(dú)立完成。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果后，學(xué)生利用軟件所給的雙參點(diǎn)數(shù)圖（圖1）[12]，區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞，同時(shí)總結(jié)不同濃度敵敵畏處理人腎細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率、早期凋亡率、晚期凋亡率，分析敵敵畏對人腎細(xì)胞凋亡的影響。

2.實(shí)驗(yàn)二：敵敵畏對人腎細(xì)胞周期的影響。在不同細(xì)胞周期狀態(tài)下，DNA的含量是不同的，其中G2/M期細(xì)胞的核酸含量是G0/G1期細(xì)胞的2倍。熒光染料PI可與雙鏈DNA分子特異性的結(jié)合，熒光強(qiáng)度的多少可以用來確定細(xì)胞中DNA的含量，從而明確細(xì)胞所處的周期狀態(tài)[16]。實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析均有學(xué)生自己獨(dú)立完成。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的結(jié)果后，學(xué)生利用MODFIT軟件分析單參數(shù)直方圖（圖2），學(xué)會分析細(xì)胞周期圖，分析細(xì)胞周期各時(shí)期所占比例，從而明確不同濃度敵敵畏對人腎細(xì)胞周期的影響[17]。

四、結(jié)語

目前，流式細(xì)胞儀已在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等課程的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中得到了應(yīng)用，但在分子生物學(xué)課程中的實(shí)驗(yàn)教學(xué)較少。隨著多學(xué)科交叉研究越來越廣泛，將流式細(xì)胞儀應(yīng)用在分子生物學(xué)課程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中就顯得比較重要。將該實(shí)驗(yàn)課引入到本科生的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程，在最大程度發(fā)揮學(xué)校大型儀器資源優(yōu)勢的同時(shí)，讓學(xué)生掌握基本實(shí)驗(yàn)技能，提高學(xué)生科研分析能力。

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Discussion on the Application of Flow Cytometrer in the Experimental Teaching

of "Molecular Biology" for Undergraduates

NIU Xi1， LI Sheng1， QI Fen-fang1，2

（1. Institute of Agro-Bioengineering， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China;

2. Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi， Guizhou 563006， China）

Abstract： According to the characteristics of experimental teaching in Molecular Biology， an opinion was proposed that flow cytometrer was used to detect cell apoptosis and cell cycle in experimental teaching of "Molecular Biology" for undergraduates. These experiments are carried out in order to enrich the content of experimental courses and improve the utilization rate of instruments. Through the practice of these experiments， students can improve their experimental skills. The course also can lay a good foundation for the technology work and scientific research and design in the future.

Key words： flow cytometrer; Molecular Biology; experiment course