基于Notch/STAT信號(hào)通路研究PCG對(duì)哮喘EOS的調(diào)控作用及分子機(jī)制

任宇哲 于宙 陳宏 楊澤一 楊祥正

[摘要] 目的 探討PCG治療哮喘的作用靶點(diǎn)及分子作用機(jī)制。 方法 將80只Wistar大鼠隨機(jī)分為Control組、Model組、平喘顆粒（PCG）組及地塞米松（DXMS）組，每組20只。聯(lián)合吸入卵白蛋白和氫氧化鋁制備哮喘模型大鼠，造模結(jié)束前5 d開(kāi)始灌胃給予相應(yīng)的藥物干預(yù)治療，每組根據(jù)成模情況取10只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。比較四組支氣管肺泡灌洗液（BALF）及血清嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）計(jì)數(shù)，EOS陽(yáng)離子蛋白（ECP）和活化趨化因子（Eotaxin）的表達(dá);采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)肺Notch、STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 Model組BALF及血清EOS計(jì)數(shù)高于Control組（均P < 0.01）;PCG組BALF及血清EOS計(jì)數(shù)低于Model組（均P < 0.01）。Model組ECP及Eotaxin含量高于Control組（均P < 0.01）;PCG組ECP及Eotaxin含量低于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。Model組Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白及mRNA表達(dá)高于Control組;Notch3，Delta1、3蛋白及mRNA表達(dá)低于Control組（均P < 0.01）。PCG組Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白及mRNA表達(dá)低于Model組;Notch3，Delta1、3蛋白及mRNA表達(dá)高于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。Model組P-STAT1、3、5、6蛋白及mRNA表達(dá)高于Control組;P-STAT4蛋白及mRNA表達(dá)低于Control組（均P < 0.01）。PCG組P-STAT1、3、5、6蛋白及mRNA表達(dá)低于Model，P-STAT4蛋白及mRNA表達(dá)高于Model組（均P < 0.01）。 結(jié)論 PCG通過(guò)調(diào)控Notch/STAT信號(hào)通路降低EOS含量治療哮喘。

[關(guān)鍵詞] 支氣管哮喘;Notch/STAT信號(hào)通路;平喘顆粒;嗜酸性粒細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）10（a）-0022-06

Molecular mechanism of Pingchuan Granules regulated EOS for asthmatic based on Notch/STAT signaling pathway

REN Yuzhe1? ?YU Zhou1? ?CHEN Hong2? ?YANG Zeyi3? ?YANG Xiangzheng

1.Department of Pediatrics， Beijing University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Shenzhen? ?518100， China; 2.Ward 1， Department of Pediatrics， the First Affiliated Hospital， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 3.School of Tradition Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100029， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic target and molecular mechanism of Pingchuan Granules in the treatment of asthma. Methods Eighty Wistar rats were randomly divided into Control group， Model group， Pingchuan Granule （PCG） group and Dexamethasone （DXMS） group， with 20 rats in each group. Asthma model rats were prepared by the method of combined inhalation of ovalbumin and aluminum hydroxide. Five days before the end of modeling， the corresponding drug intervention treatment was given by gavage. According to the modeling condition， ten of each group were selected for subsequent experiments. Bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and serum eosinophilic granulocyte （EOS） counts， EOS cationic protein （ECP） and activated chemokine expression （Eotaxin） were compared among the four groups. Expression of proteins and mRNA related to Notch and STAT signaling pathways in lung were measured by RT-PCR and Western blot. Results BALF and serum EOS counts in Model group were higher than those in Control group （all P < 0.01）， BALF and serum EOS counts in PCG group were lower than those in Model group （all P < 0.01）. The content of ECP and Eotaxin in Model group were higher than those in Control group （all P < 0.01）， and the content of ECP and eotaxin in PCG were lower than those in Model group （P < 0.05 or P < 0.01）. Notch1， 2， 4， Hes， Jagged1， Delta4 protein and mRNA expression in Model group were higher than those in Control group， and the expression of Notch3， Delta1， 3 protein and mRNA were lower than those in Control group （all P < 0.01）. Notch1， 2， 4， Hes， Jagged1， Delta4 protein and mRNA expression in PCG group were lower than those in Model group and the expression of Notch3， Delta1， 3 protein and mRNA were higher than those in Model group （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression of P-STAT1， 3， 5， 6 protein and mRNA in Model group were higher than those in Control group， and P-STAT4 protein and mRNA were lower than those in Control group （all P < 0.01）. The expression P-STAT1， 3， 5， 6 protein and mRNA in PCG group were lower than those in Model group， and P-STAT4 protein and mRNA were higher than those in Model group （all P < 0.01）. Conclusion PCG can reduce EOS by regulating Notch/STAT signaling pathway in the treatment of asthma.

[Key words] Bronchial asthma; Notch/STAT signaling pathway; Pingchuan Granules; Eosinophil

支氣管哮喘是一種慢性炎癥性氣道疾病和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，主要炎癥成分為嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）[1-2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示[3]，EOS浸潤(rùn)與氣道反應(yīng)性的增加顯著相關(guān)，并繼續(xù)在肺中積累和激活。研究報(bào)道稱信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）家族、Notch信號(hào)通路在哮喘的發(fā)病中與EOS的分化及增殖也密切相關(guān)[4-5]。目前其常用治療為免疫抑制治療，如激動(dòng)劑、糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、基因治療等[6]。盡管哮喘的治療已取得了一些進(jìn)展，但仍缺乏有效且副作用小的藥物。

哮喘在中醫(yī)歸為“哮證”，以“發(fā)時(shí)治標(biāo)，平時(shí)治本”為主要治則[7]。本課題組多年來(lái)致力于研究組方平喘顆粒（PCG），通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)其在治療肺功能方面臨床效果顯著。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)其具有平喘、鎮(zhèn)咳、化痰等作用，但是關(guān)于PCG否通過(guò)調(diào)控Notch/STAT信號(hào)通路發(fā)揮作用有待進(jìn)一步探究。

因此本研究通過(guò)建立哮喘動(dòng)物模型以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究PCG對(duì)哮喘的改善作用，并進(jìn)一步探討其是否通過(guò)調(diào)控Notch/STAT信號(hào)通路影響EOS的分子機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Wistar大鼠80只，雄性，8周齡，體重（200±20）g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證：11400700256012，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)條件：室溫22～26℃，相對(duì)濕度50%～70%，保持通風(fēng)良好，黑白交替各12 h，自由攝食飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循“3R原則”以及人道關(guān)懷。

1.2 主要儀器與試劑

定量PCR儀（SimpliAmp，賽默飛）;全自動(dòng)血液分析儀（HM，美國(guó)庫(kù)克曼庫(kù)爾股份有限公司）;PCR擴(kuò)增儀（ATC，賽默飛）;Bio-Rad電泳儀（PowerPac系列，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）。

卵清白蛋白（Sigma，O1641）;IgE酶聯(lián)免疫試劑盒（Sigma，RAB0799）;ECP酶聯(lián)免疫試劑盒[齊一生物科技（上海），QY-R2220]、Eotaxin酶聯(lián)免疫試劑盒（Sigma，RAB0043）;烏拉坦（武漢宏信康精細(xì)化工，51-79-6）;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒（Roche，11732650001）。PCG由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室，150207），由淫羊藿15 g、黃芪10 g、款冬花12 g、炙麻黃10 g、太子參10 g、罌粟殼4 g、五味子10 g、知母10 g、地龍10 g組成。將其制備成每千克含91 g生藥的顆粒，經(jīng)換算大鼠的給藥劑量為10 mL/kg。地塞米松磷酸鈉注射液（DXMS，國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，1 mL：5 mg，11030022）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.3.1 哮喘模型的建立? Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，在實(shí)驗(yàn)的第0、12天，每只大鼠腹腔注射1 mg卵白蛋白（OVA）和100 mg氫氧化鋁凝膠無(wú)菌耐濃縮液（1 mL）致敏，并用5% OVA連續(xù)刺激5 d，每次30 min，1次/d，5 d后隔天激發(fā)1次，刺激6周，建立慢性哮喘模型，成模率>90%，對(duì)照組腹腔注射相應(yīng)體積的10% OVA溶液。

1.3.2 分組及給藥? 80只大鼠隨機(jī)分為Control組、Model組、PCG組（5.4 g/kg）、DXMS組（1 mg/kg），每組20只。在造模結(jié)束前5 d開(kāi)始給藥，PCG組和DXMS組給予相應(yīng)藥物，Control組和Model組給予等量的蒸餾水，激發(fā)時(shí)在激發(fā)前1 h給予相應(yīng)藥物，1次/d。同時(shí)，每天觀察動(dòng)物的基本體征。造模給藥結(jié)束后，每組根據(jù)成模情況取10只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材? 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從腹主動(dòng)脈收集血液，并將其放入乙二胺四乙酸抗凝管中。分離頸部血管和神經(jīng)，暴露氣管，切1個(gè)小V形開(kāi)口，并進(jìn)行氣管插管。將右肺結(jié)扎，5 mL預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗左支氣管，收集支氣管肺泡灌洗溶液（BALF）。取肺組織，右肺上葉用4%多聚甲醛固定。液氮迅速冷凍右肺下葉組織以備使用。

組織勻漿：準(zhǔn)確稱取適量右肺下葉組織，加入9倍體積的緩沖溶液或氯化鈉溶液于低溫冷藏，后加1 mg/L蛋白酶抑制劑或50 U/mL抑肽酶，制成10%組織勻漿液（W/V），3000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm）。沉淀用于提取組織蛋白，上清液用于檢測(cè)各種生化指標(biāo)。

1.4.2 生理狀態(tài)觀察? 根據(jù)體重調(diào)節(jié)大鼠的給藥劑量，稱重1次/3 d。同時(shí)，觀察大鼠在刺激或致敏過(guò)程中的生理變化，如呼吸頻率和精神狀態(tài)等。

1.4.3 BALF及血清EOS計(jì)數(shù)? BALF以2000 r/min離心5 min（半徑10 cm），棄去上清液，沉淀物稀釋并重懸于1 mL預(yù)冷PBS中?；旌峡鼓苤械难?，放置20 min。通過(guò)自動(dòng)五分類血液分析儀檢測(cè)BALF及血清EOS計(jì)數(shù)。

1.4.4 血清EOS活化標(biāo)志物檢測(cè)? 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，對(duì)四組血清EOS活化標(biāo)志物陽(yáng)離子蛋白（ECP）、趨化因子（Eotaxin）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 BALF中EOS細(xì)胞的分離與培養(yǎng)? 四組BALF液經(jīng)處理獲得EOS細(xì)胞。將分離和純化的EOS細(xì)胞在含有10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至2×105個(gè)/孔，添加10 U/mL白細(xì)胞介素-5，并置于培養(yǎng)板上，在5%CO2和37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.6 EOS細(xì)胞的鑒定（Wright-Giemsa染色）? 首先漿細(xì)胞涂片于撥片上、自然干燥;滴加瑞氏染液染1 min;加等體積的PBS（pH=6.4）混勻后室溫靜置5～10 min;水洗、干燥、鏡檢。

1.4.7 肺組織Notch、STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)? 稱取肺組織進(jìn)行研磨、離心得到蛋白上清液，BCA試劑盒檢測(cè)組織總蛋白含量，加入loading上樣緩沖液和裂解液進(jìn)行定量，100℃水浴15 min。通過(guò)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作后，一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育，最后放置于化學(xué)發(fā)光成像儀曝光成像，檢測(cè)Notch、STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.4.8 肺組織Notch、STAT信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)的檢測(cè)? 取肺組織50 mg，勻漿后Trizol試劑提取總RNA，測(cè)其濃度和純度。采用RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，反應(yīng)體系：1 μL Oligo（dT）18（0.5 μg/mL），10 μL 2×TS Reaction Mix TS Enzyme Mix，1 μL DNA 酶，20 μL RNase-free water至總體積為32 μL。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)Notch、STAT和GAPDH基因進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)，引物交由蘇州金唯智生物科技有限公司（北京公司）合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組一般行為學(xué)變化

Control組大鼠表現(xiàn)為亮發(fā)，活動(dòng)正常，規(guī)律攝食攝水，正常呼吸頻率，抓握時(shí)迅速逃脫;Model組大鼠進(jìn)食減少，頭發(fā)直立，稀疏干燥，呼吸急促常伴有喘息，呼吸頻率增加，多數(shù)有咳嗽現(xiàn)象，腹部肌肉抽搐和煩躁不安。與Model組比較，DXMS、PCG組大鼠飲食增加，活動(dòng)更容易移動(dòng)，呼吸和喘息頻率降低，毛發(fā)光澤，偶爾咳嗽，哮喘癥狀減輕。

2.2 四組BALF及血清EOS計(jì)數(shù)比較

Model組BALF及血清EOS計(jì)數(shù)高于Control組（均P < 0.01）;PCG組BALF及血清EOS計(jì)數(shù)低于Model組（均P < 0.01）。見(jiàn)表2。

2.3 四組ECP及Eotaxin含量比較

Model組ECP及Eotaxin含量高于Control組（均P < 0.01）;PCG組ECP及Eotaxin含量低于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表3。

2.4 EOS形態(tài)鑒定

細(xì)胞著色均勻分布，細(xì)胞形態(tài)一致且均呈粉紅色圓形，Wright-Giemsa染色呈陽(yáng)性，提示分離所得細(xì)胞為EOS細(xì)胞，純度檢測(cè)顯示其純度均>95%。見(jiàn)圖1（封四）。

2.5 四組Notch信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

Model組Notch1、2、4，Hes，Jagged1、2，Delta4蛋白表達(dá)高于Control組;Notch3，Delta1、3蛋白表達(dá)低于Control組（均P < 0.01）。PCG組Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白表達(dá)低于Model組;Notch3，Delta1、3蛋白表達(dá)高于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖2。

2.6 四組STAT信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

Model組P-STAT1、3、5、6蛋白表達(dá)高于Control組，P-STAT4蛋白表達(dá)低于Control組（均P < 0.01）;PCG組P-STAT1、3、5、6蛋白表達(dá)低于Model組，P-STAT4蛋白表達(dá)高于Model組（均P < 0.01）。見(jiàn)圖3。

2.7 四組Notch信號(hào)通路mRNA表達(dá)比較

Model組Notch1、2、4，Jagged1，Delta4，Hes mRNA表達(dá)高于Control組，Notch3，Delta1、3 mRNA表達(dá)低于Control組（均P < 0.01）;PCG組Notch1、2、4，Jagged1，Delta4，Hes mRNA表達(dá)低于Model組，Notch3，Delta1、3 mRNA表達(dá)高于Model組（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖4。

2.8 四組STAT信號(hào)通路mRNA表達(dá)比較

Model組P-STAT1、3、5、6 mRNA表達(dá)高于Control組，P-STAT4 mRNA表達(dá)低于Control組（均P < 0.01）;PCG組P-STAT1、3、5、6 mRNA表達(dá)低于Model組，P-STAT4 mRNA表達(dá)高于Model組（均P < 0.01）。見(jiàn)圖5。

3 討論

哮喘是一種有EOS、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的炎癥性疾病，EOS在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-9]。本研究應(yīng)用OVA與氫氧化鋁聯(lián)合吸入法建立哮喘大鼠模型，探究PCG對(duì)哮喘的治療作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，哮喘模型中EOS在BALF[10-11]、肺部[12]、外周血液[13]表達(dá)均升高，且EOS脫顆粒產(chǎn)物ECP、活化刺激物Eotaxin在氣道平滑肌、肺組織和血清表達(dá)升高[14-17]。本研究制備哮喘模型的肺組織和支氣管中出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、EOS過(guò)表達(dá)、氣道重塑和肺組織損傷，提示IgE介導(dǎo)的哮喘模型復(fù)制成功[18-20]。本研究結(jié)果顯示，PCG組BALF及血清EOS計(jì)數(shù)、ECP和Eotaxin顯著下降（P < 0.05），推測(cè)PCG能夠通過(guò)抑制EOS達(dá)到治療支氣管哮喘的目的。

支氣管哮喘是由IgE介導(dǎo)的一種變態(tài)反應(yīng)性氣道炎癥，EOS為其主要效應(yīng)細(xì)胞，而Notch信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)EOS的遷移和分化，由此推斷Notch信號(hào)通路與哮喘的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián)[21-22]。賴天文等[23]研究結(jié)果顯示，哮喘模型鼠中Notch及其配體顯著增加，且Notch的靶基因Hes mRNA在血清及BALF中均顯著性上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，PCG通過(guò)回調(diào)Notch信號(hào)通路Notch1、2、4，Delta1、3，Jagged1，Hes的表達(dá)，改善肺組織和氣道炎癥以及氣道重塑。實(shí)際是通過(guò)改善肺部EOS中Notch信號(hào)通路的表達(dá)，即PCG的靶細(xì)胞為EOS，其調(diào)控的相關(guān)的靶點(diǎn)為Notch1、2、4，Delta1、3，Jagged1，Hes。因此推斷PCG對(duì)哮喘模型中的EOS有調(diào)節(jié)作用，作用機(jī)制與Notch有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)[24-25]，哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)EOS中存在STAT家族表達(dá)。阻斷STAT信號(hào)通路的表達(dá)可抑制EOS細(xì)胞的趨化和黏附，從而抑制呼吸道EOS浸潤(rùn)控制哮喘發(fā)生[26-27]。本研究結(jié)果顯示，PCG對(duì)STAT1、3、4、5、6蛋白和mRNA的表達(dá)均有顯著改善作用，提示PCG通過(guò)上調(diào)P-STST4蛋白和mRNA的表達(dá)，下調(diào)P-STAT1、3、5、6蛋白和mRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)氣道重塑和炎癥的調(diào)控作用，即PCG通過(guò)調(diào)控肺組織STAT活性從而發(fā)揮改善哮喘的作用。因此推測(cè)PCG對(duì)哮喘模型中的EOS有調(diào)節(jié)作用，作用機(jī)制與STAT有關(guān)。

總之，PCG可通過(guò)減少EOS的數(shù)量，調(diào)節(jié)EOS的Notch和STAT信號(hào)通路中的許多環(huán)節(jié)從而改善超敏和炎癥反應(yīng)，并抑制氣道重塑，從而達(dá)到改善大鼠哮喘模型的哮喘特征。

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（收稿日期：2020-04-17）