三仁湯對(duì)脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠的作用機(jī)理

鄒先明 吳瑩 吳歡

摘要：目的?探究三仁湯對(duì)脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠關(guān)性的作用機(jī)理。方法?將50只健康清潔級(jí)SD大鼠視為研究對(duì)象，經(jīng)數(shù)字隨機(jī)法分為隨機(jī)分為正常組、模型組、高劑量三仁湯組、中劑量三仁湯組和低劑量三仁湯組，總共5組，每組各10只，利用復(fù)合因素復(fù)制脾胃濕熱證癌前病變模型大鼠。采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)P53、Bcl-2;采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）;采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、白細(xì)胞介素10（IL-10）和環(huán)氧化酶2（COX-2），并進(jìn)行組間比較和分析。結(jié)果?在P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平方面，模型組要明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05）;三仁湯（高、中、低劑量）組均明顯低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。在血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平方面，模型組要明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），三仁湯（高、中、低劑量）組均低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。結(jié)論?三仁湯對(duì)脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠關(guān)性的作用機(jī)理能表現(xiàn)為下調(diào)脾胃濕熱模型大鼠胃黏膜P53、P21ras、Bcl-2、AI、COX-2蛋白水平的，抑制血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10過度反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：三仁湯;脾胃濕熱證;胃癌癌前病變;炎性因子;細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R285.5?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1007-2349（2020）11-0063-04

【Abstract】Objective： To explore the mechanism of Sanren Decoction on gastric precancerous lesions in rats with spleen-stomach damp-heat syndrome. Methods： 50 healthy and clean SD rats were regarded as the research objects and were randomly divided into normal group， model group， high-dose， medium-dose and low-dose Sanren Decoction groups. 5 groups in total， 10 rats each group. The model rats were made by using compound factors to replicate precancerous lesion with spleen-stomach damp-heat syndrome. The immunohistochemical detection method was used to detect P53 and Bcl-2 and the in situ end labeling method to detect cell apoptosis index （AI）， enzyme-linked immunosorbent method （ELISA） to detect interleukin 1β （IL-1β）， leukocyte mediator Interleukin 6 （IL-6）， Interleukin 8 （IL-8）， Interleukin 10 （IL-10） and Cyclooxygenase 2 （COX-2）. The comparison and analysis were made among the groups. Results： In terms of levels of P53， Bcl-2， P21ras， AI， and COX-2， the model group was significantly higher than the normal control group （P<0.05） and Sanrentang groups （high， medium， and low dose） were significantly lower than the model group （P<0.05）. The medium-dose group had the most obvious reduction effect. In terms of serum IL-1β， IL-6， IL-8 and IL-10 levels， the model group was significantly higher than the normal control group （P<0.05） and the Sanrentang groups （high， medium， and low dose） were all lower than the model group （P<0.05）. The medium-dose group had the most obvious reduction effect. Conclusion： The mechanism of action of Sanren Decoction on gastric precancerous lesions in model rats with spleen-stomach damp-heat syndrome can be represented by down-regulating the gastric mucosal P53， P21ras， Bcl-2， AI， COX-2 protein levels in the model rats with the spleen and stomach damp-heat syndrome and inhibiting the overreaction of serum IL-1β， IL-6， IL-8 and IL-10.

【Key words】Sanren Decoction， spleen-stomach damp-heat syndrome， gastric precancerous lesions， inflammatory factors， cell apoptosis

胃癌是臨床最為常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于各個(gè)年齡段群體中，多以40歲以后群體為主，男性發(fā)病無明顯差異，具有較高的致死率，會(huì)嚴(yán)重威脅患者的生命安全。目前，臨床對(duì)于胃癌的治療并無特效手段，無論是手術(shù)治療，還是放化療，5年生存率均比較低[1]。研究顯示[2]，胃癌前病變的早期階段多見脾胃濕熱證。脾胃濕熱證與胃癌前病變的發(fā)病機(jī)制均與炎癥病變及細(xì)胞增殖與凋亡的失衡密切相關(guān)，炎癥可以改變癌基因和抑制癌基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞向惡化發(fā)展，炎癥因子能活化大多數(shù)細(xì)胞的生存信號(hào)，從本質(zhì)上促成腫瘤的形成[3]。對(duì)胃黏膜癌前病變的臨床防治，目前西醫(yī)尚缺乏理想藥物和治療手段，中醫(yī)藥在此方面有獨(dú)特作用和明顯優(yōu)勢(shì)。三仁湯是中醫(yī)學(xué)疾病治療的一種重要中藥方劑，其主要功能為清利濕熱，在治療濕熱初起方面有很強(qiáng)的功效。為此，本實(shí)驗(yàn)探討三仁湯對(duì)脾胃濕熱證型胃癌癌前病變模型大鼠性作用機(jī)理，旨在為臨床提供一定的理論參考?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1?材料與方法

1.1?一般材料?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)SD大鼠50只，均購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)（SCXK（粵）2006-0015），體質(zhì)量180～220 g，平均體質(zhì)量（200.23±11.07）g。通過數(shù)字隨機(jī)表法分組，每組各10只。

三仁湯出藥方構(gòu)成：杏仁15 g，制半夏15 g，薏苡仁18 g，飛滑石18 g，白通草6 g，白蔻仁（后下）6 g，竹葉6 g，厚樸各6 g。上述各藥物先用清水浸泡30 min，然后根據(jù)藥量：水量為1：8的原則煎煮3次，3次藥汁混合，離心取澄清藥汁。隨后進(jìn)行藥物配制，三種濃度分別為0.41，0.82，1.64 g/mL，保存待用。

高糖高脂飼料：將12%豬油、8%蜂蜜與普通飼料融合加工（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。濃度為109/mL的大腸埃希桿菌液（細(xì)菌編號(hào)：44113-10，ATEC25992，中國(guó)微生物研究所提供）。

儀器設(shè)備：Avanti TM230 型 超 速 冷 凍 離 心 機(jī)（美 國(guó)BECKMAN 公司）;PL303 型電子天平（梅特勒托利多儀器<上海>有限公司）;SN-695 型放射免疫 r 計(jì)數(shù)測(cè)量系統(tǒng)（上海核輔光電儀器有限公司）;南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生熱帶學(xué)院仿真模擬氣候倉（可以調(diào)節(jié)溫度、濕度、風(fēng)速等）。

1.2?造模方法?正常對(duì)照組：采用普通飼料喂養(yǎng)，溫度和相對(duì)濕度分別控制為20～28 ℃、50%～60%的。

脾胃濕熱證大鼠模型組：采取“濕熱環(huán)境+高脂高糖飲食+白酒”法先建立脾胃濕熱證模型，再在此基礎(chǔ)上每日自由飲用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）溶液+饑飽失常的綜合方法，造成胃黏膜上皮的中、重度不典型增生及不完全性腸化生，建立脾胃濕熱胃癌前病變大鼠模型。

三仁湯組：低劑量0.41 g/mL，中劑量0.82 g/mL，高劑量1.62/mL。在脾胃濕熱證大鼠模型的基礎(chǔ)上，移出置于自然環(huán)境12 h后開始灌服三仁湯煎劑，2 mL/200 g，每日1次，7 d后動(dòng)物處死做相關(guān)檢查。

1.3?標(biāo)本檢測(cè)?標(biāo)本采集：大鼠處死前禁食12 h，用10%水合氯醛按0.7 mL/200 mg腹腔注射麻醉，迅速打開腹腔。經(jīng)腹主動(dòng)脈采血2 mL注入普通采血管待凝固后，在4℃環(huán)境下，放置3000 r/min條件下進(jìn)行離心，持續(xù)10 min，靜置15 min后將上層血清分離，-20 ℃保存待檢。

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) P53、Bcl-2、P21ras的表達(dá)，采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、白細(xì)胞介素10（IL-10）和環(huán)氧化酶2（COX-2）。具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書操作。

1.4?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?搜集、整理2組患者的上述數(shù)據(jù)，比如手術(shù)時(shí)間、術(shù)中出血量、住院時(shí)間等，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS23.0版）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，對(duì)比操作實(shí)行χ2檢驗(yàn)和 t檢驗(yàn)，當(dāng)P值在 0.05 以下時(shí)，提示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?各組P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平的比較?在P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平方面，模型組要明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;三仁湯（高、中、低劑量）組均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。如表1所示。

2.2?各組血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10對(duì)比?在血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平方面，模型組要明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），三仁湯（高、中、低劑量）組均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯。詳情見表2。

3?討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，脾胃濕熱證多涉及消化系統(tǒng)，在消化系統(tǒng)疾病中較為常見，具有反復(fù)發(fā)作、復(fù)雜性高、治愈難度大等特點(diǎn)，其中脾胃濕熱證是慢性胃炎中醫(yī)分型的常見病型[4]。研究認(rèn)為濕熱證可能是慢性胃炎向癌前病變及早期癌過度的病理階段[5]。有研究表明：脾胃濕熱證有癌變傾向[6]。三仁湯是中醫(yī)方劑經(jīng)典方，其組成為杏仁、制半夏、薏苡仁、飛滑石、白通草、白蔻仁（后下）、竹葉、厚樸?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究顯示：三仁湯中各單味藥物均有不同程度的抑制腫瘤作用，同時(shí)臨床有運(yùn)用本方治療胃癌前病變濕熱內(nèi)蘊(yùn)證的報(bào)道，為本方用治脾胃濕熱胃癌前病變提供了一定的藥理學(xué)及臨床基礎(chǔ)。

脾胃濕熱證的病變中心為脾胃，脾胃的病變又以其功能病變?yōu)楹诵?，而胃黏膜上皮?xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡又會(huì)對(duì)脾胃功能產(chǎn)生關(guān)鍵性的影響，若此種平衡被打破，極有可能引起脾胃功能病變。細(xì)胞凋亡是個(gè)體發(fā)育過程中由一系列基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，在多數(shù)細(xì)胞類型中，基因Bcl-2與P53是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡中相互聯(lián)系，相互作用，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[7]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，模型組P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2水平均明顯下降（P<0.05），表明了造模成功。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，三仁湯（高、中、低劑量）組均明顯低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯，說明了三仁湯對(duì)脾胃濕熱證大鼠胃粘膜上皮細(xì)胞增殖與凋亡失衡的調(diào)節(jié)，可能通過下調(diào)增殖與凋亡相關(guān)P53、Bcl-2及COX-2 基因蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。脾胃濕熱證以脾胃為病變中心，經(jīng)過長(zhǎng)期的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究表明：中醫(yī)的脾胃濕熱證與胃病、胃黏膜病理改變之間存在著非常密切的關(guān)系。研究顯示[8]，白細(xì)胞介素類是一族重要的細(xì)胞因子，其中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等均有一定的促炎性作用，濕熱證模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10含量的變化顯著，進(jìn)一步說明濕熱證本質(zhì)與炎癥及免疫病理關(guān)系密切。最新研究表明[8]：炎癥可以改變癌基因和抑制癌基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)化，以促進(jìn)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)變。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10水平均明顯下降（P<0.05），說明造模成功。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，三仁湯（高、中、低劑量）組均低于模型組（P<0.05），以中劑量組降低效果最為明顯，初步提示三仁湯治療溫病濕熱證諸癥的機(jī)制為調(diào)節(jié)血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 等炎癥因子在機(jī)體內(nèi)的含量，降低炎癥反應(yīng)程度，平衡免疫，提高治愈速度。

綜上所述，三仁湯可能通過下調(diào)脾胃濕熱模型大鼠胃黏膜P53、Bcl-2、P21ras、AI、COX-2蛋白水平，糾正脾胃濕熱證大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞增殖與凋亡的失衡，調(diào)節(jié)血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 等炎癥因子在機(jī)體內(nèi)的含量，降低炎癥反應(yīng)程度，從而促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)。本研究充分秉承三仁湯辛開苦降、燥濕泄熱、調(diào)達(dá)脾胃的組方理念，更深入挖掘經(jīng)典方的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床推廣運(yùn)用提供強(qiáng)有力的證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳雨軒，莊麗維.胃癌相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（5）：63-68.

[2]李秋晨，鄭勇，尚國(guó)臣，等.胃癌及胃黏膜癌前病變組織SSBP1表達(dá)臨床意義[J].中華腫瘤防治雜志，2018，25（5）：325-328.

[3]李云鵬，文小敏，武凱歌，等.三仁湯對(duì)脾胃濕熱證大鼠行為學(xué)及下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（1）：126-128.

[4]謝曉平，林阿豐，陳曉帆.胃癌前病變中醫(yī)辨證分型與Hp感染相關(guān)性的研究[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，40（4）：60-62.

[5]季旭明，莊凌云，崔有利，等.三仁湯對(duì)濕熱證型病毒性肺炎小鼠模型的多靶點(diǎn)干預(yù)作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2019，12：213-214.

[6]劉寶珍.慢性萎縮性胃炎中醫(yī)證型與幽門螺桿菌感染、病理分級(jí)的相關(guān)性研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，12（4）：612-614.

[7]魯香鳳，聶里紅，毛穎秋，等.慢性胃炎3種證型胃黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，15（12）：5323-5328.

[8]顏勤.三仁湯對(duì)溫病濕熱證大鼠模型白介素及免疫球蛋白的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2017，22（9）：506-509.

（收稿日期：2020-06-22）