基于blaCARB-17基因建立水產(chǎn)品中副溶血弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法

胡元慶，沈子晨，李鳳霞，呂琳雪，周贊虎

1(閩南師范大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州，363000)2(揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州，225000)3(漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 漳州，363000)

水產(chǎn)品食物中毒主要由副溶血弧菌引起，給人們的健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[1]，同時(shí)也給物聯(lián)網(wǎng)趨勢(shì)下的食品安全帶來(lái)挑戰(zhàn)[2]。因處理不當(dāng)使不同類(lèi)型的水產(chǎn)品發(fā)生細(xì)菌交叉污染，食用后有可能導(dǎo)致食物中毒[3]，急性發(fā)作、嘔吐、腹痛、腹瀉及水樣便是主要臨床表現(xiàn)[4]。副溶血弧菌在食品環(huán)境中受到多種抗生素壓力而產(chǎn)生耐藥性，如鏈霉素、氨芐青霉素和頭孢類(lèi)，長(zhǎng)期處于該環(huán)境可產(chǎn)生大量的多重耐藥菌株[5-6]。建立針對(duì)副溶血弧菌快速檢測(cè)技術(shù)是預(yù)防及控制該菌的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法是檢測(cè)食源性病原菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其耗時(shí)長(zhǎng)(一般4～7 d)、程序繁雜、工作量較大，難以滿足快速檢測(cè)的實(shí)際需求。目前，檢測(cè)副溶血弧菌的分子方法有常規(guī)PCR法[7-8]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[9-10]和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等[11]。這些技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，但因儀器價(jià)格昂貴，難以開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一種在恒溫條件下使DNA大量擴(kuò)增的新技術(shù)，其針對(duì)靶序列的6個(gè)特定區(qū)域，設(shè)計(jì)4條特異性引物，通過(guò)BstDNA聚合酶的鏈置換和鏈延伸作用實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增[12]。與常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相比，LAMP具有更高的靈敏性和特異性，且不需要特殊儀器，能在1 h內(nèi)獲得足量目的DNA用于分析[13]?；谝陨蟽?yōu)勢(shì)，LAMP適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)病原菌。近年來(lái)，全球?qū)W者報(bào)道了用于檢測(cè)副溶血弧菌的LAMP方法。YAMAZAKI等[14]于2008年以tlh基因?yàn)闄z測(cè)位點(diǎn)首次建立了副溶血弧菌的LAMP技術(shù)，最低檢測(cè)限可達(dá)5.3×102CFU/mL。后來(lái)建立了針對(duì)副溶血弧菌toxR基因的LAMP方法[15]。這些方法不能用于鑒別致病性菌株，于是建立了針對(duì)毒力基因tdh和trh的LAMP方法[16]。學(xué)者根據(jù)檢測(cè)需要也建立了多重LAMP[16-17]、原位LAMP[18]、多重核酸內(nèi)切酶限制實(shí)時(shí)LAMP[19]、LAMP-LFD(loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick)[20]和微流體LAMP[21]等技術(shù)。國(guó)內(nèi)學(xué)者也建立了針對(duì)副溶血弧菌tlh[22-23]、tdh[24]、trh[24]、ompA[25]和toxR[26]等基因的LAMP技術(shù)。

近年來(lái)，通過(guò)副溶血弧菌比較基因組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)一種新的分子遺傳標(biāo)記。CHIOU等[27]于2015年報(bào)道了副溶血弧菌的青霉素耐藥性源于一種β內(nèi)酰胺酶編碼基因-17(class A carbenicillin-hydrolyzing β-lactamase family-17,blaCARB-17)，在GenBank的293株副溶血弧菌和91株食品分離株中均發(fā)現(xiàn)該基因。LI等[28]在2016年證明副溶血弧菌的blaCARB-17是一種高特異的遺傳學(xué)標(biāo)記，相對(duì)于tlh、atpA更為保守，特異性更高[29]，而針對(duì)tlh和atpA基因的PCR檢測(cè)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性[28]。本研究基于副溶血弧菌新的特異性靶點(diǎn)blaCARB-17建立并優(yōu)化LAMP擴(kuò)增體系和條件，探究其特異性、靈敏性和可靠性，以滿足水產(chǎn)品現(xiàn)場(chǎng)高效快檢的實(shí)際需要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：副溶血弧菌(VibrioparahaemolyticusATCC17802)、志賀氏菌(ShigellaB4)、大腸桿菌(EscherichiacoliD5)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC26003)、沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis50041)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes54001)由漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心微生物檢測(cè)室惠贈(zèng)，在生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：BstDNA聚合酶大片段、100 mmol/L MgSO4、6×Loading Buffer、Gel Stain(10 000×)核酸染料、dNTP、10×反應(yīng)緩沖液、Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker，北京全式金生物科技有限公司；GK1071細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)、SYBR Green I，上海捷瑞生物工程有限公司；TCBS培養(yǎng)基、3%氯化鈉堿性蛋白胨水，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

主要儀器：UV超靈敏多功能成像儀(Amersham Imager 600)，美國(guó)通用電氣公司；高速離心機(jī)(MIKRO120)，德國(guó)Hettich公司；立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-30R)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9050MBE)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電泳儀(Power B)，北京凱元信瑞儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2)，常州國(guó)華電器有限公司；恒溫振蕩搖床(HQY-C)，金壇市鴻科儀器廠；超微量分光光度計(jì)(Nanodrop One)，基因有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA模板的制備

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802劃線于TCBS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)得到單菌落。挑取單菌落到3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，200 r/min振蕩培養(yǎng)得到菌懸液。取1 mL菌懸液，以12 000 r/min離心2 min收集菌體，沉淀按照GK1071細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒操作說(shuō)明提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

選擇副溶血弧菌blaCARB-17基因?yàn)槟繕?biāo)序列，用Primer Explorer V4軟件(http://primerexplore-r.jp/e/)，在線設(shè)計(jì)LAMP的內(nèi)引物FIP、BIP和外引物F3、B3，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。tlh基因引物參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為450 bp。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.3.1 LAMP擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系(25 μL)：50 mmol/L MgSO4(2.4 μL)，10 mmol/L dNTPs (3.6 μL)，10×反應(yīng)緩沖液(2.5 μL)，10 μmol/L F3和B3(各0.5 μL)，10 μmol/L FIP和BIP (各4 μL)，DNA模板(1 μL)，8 U/μLBstDNA聚合酶(1 μL)，無(wú)菌雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)足25 μL，混勻。在63 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min，80 ℃、20 min酶滅活結(jié)束反應(yīng)。取4 μL產(chǎn)物在質(zhì)量濃度20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，同時(shí)加1 μL SYBR Green Ⅰ(1 000×)至反應(yīng)管中肉眼觀察顏色變化。

1.3.2 PCR擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系(25 μL)：2×PowerTaqPCR Master Mix預(yù)混液(12.5 μL)，L-tlh和R-tlh引物(各1 μL)，副溶血弧菌DNA模板(3 μL)，用ddH2O補(bǔ)齊25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃、3 min預(yù)變性；94 ℃變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，25次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物在質(zhì)量濃度15 g/L瓊脂糖凝膠上電泳分析。

1.4 LAMP體系的優(yōu)化

對(duì)BstDNA聚合酶量、內(nèi)外引物濃度比、dNTPs濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別進(jìn)行優(yōu)化，參數(shù)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。對(duì)某一條件優(yōu)化時(shí)，其他參數(shù)按照1.3.1小節(jié)進(jìn)行。

表2 LAMP體系中參數(shù)優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of parameter optimization in LAMP system

1.5 特異性試驗(yàn)

以單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌作為對(duì)照，先分別得到液體培養(yǎng)物，用試劑盒提取各自基因組DNA，然后各取1 μL DNA模板加入已優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，分析LAMP檢測(cè)副溶血弧菌的特異性。

1.6 靈敏性試驗(yàn)

將副溶血弧菌ATCC17802按照1.2.1小節(jié)的方法制備基因組DNA模板，然后用Nanodrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定其初始濃度，倍比稀釋得到不同濃度的DNA模板。分別取1 μL模板溶液加入已優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，電泳與SYBR Green Ⅰ染料分析，確定其靈敏度。

1.7 人工污染模擬試驗(yàn)

將副溶血弧菌ATCC17802液體擴(kuò)大培養(yǎng)，利用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整菌懸液濃度為1×107CFU/mL，并進(jìn)行10倍梯度稀釋，使菌懸液濃度為1～1×107CFU/mL，取1 mL菌液分別均勻涂布于新鮮蝦樣品表面，室溫放置4 h后，用1 mL ddH2O沖洗回收菌液，用1.2.1小節(jié)的方法提取基因組DNA。各取1 μL DNA模板加入已優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，得出人工污染樣品的檢測(cè)限。

1.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

采集水產(chǎn)市場(chǎng)新鮮花蛤、牡蠣和蝦樣品共144份，通過(guò)國(guó)標(biāo)方法分離鑒定副溶血弧菌，并用常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)分離株的tlh基因。對(duì)陽(yáng)性樣品用無(wú)菌ddH2O回收菌體，提取基因組后用優(yōu)化的LAMP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，分析其可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP體系的建立

本試驗(yàn)針對(duì)副溶血弧菌blaCARB-17基因設(shè)計(jì)一套特異性引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。圖1-a所示為電泳檢測(cè)結(jié)果，陰性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物未顯示階梯狀條帶，副溶血弧菌ATCC17802的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物顯示階梯狀條帶；圖1-b所示為SYBR Green Ⅰ染色檢測(cè)結(jié)果，副溶血弧菌ATCC17802的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物變熒光綠，陰性對(duì)照管為橘黃色。結(jié)果表明，建立的LAMP體系能正確擴(kuò)增目的基因，用于檢測(cè)副溶血弧菌。

a-LAMP產(chǎn)物電泳檢測(cè)；b-LAMP產(chǎn)物SYBR Green Ⅰ染色檢測(cè)；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2-副溶血弧菌ATCC17802標(biāo)準(zhǔn)株基因組圖1 副溶血弧菌ATCC17802標(biāo)準(zhǔn)株LAMP結(jié)果Fig.1 Results of LAMP detection of Vibrio parahaemolyticus standard strain ATCC17802

2.2 LAMP各主要參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 優(yōu)化Mg2+濃度

本實(shí)驗(yàn)對(duì)LAMP反應(yīng)體系中1.2～7.2 mmol/L遞增濃度的Mg2+進(jìn)行了考察。如圖2-a所示，陰性對(duì)照和濃度為1.2 mmol/L的Mg2+沒(méi)有階梯狀條帶產(chǎn)生；其余的反應(yīng)管均顯示階梯狀條帶，電泳條帶清晰度和亮度最佳的Mg2+濃度為2.4 mmol/L。如圖2-b所示，橘黃對(duì)應(yīng)的為陰性對(duì)照管和Mg2+濃度為1.2 mmol/L的反應(yīng)液，其余反應(yīng)液均為熒光綠。圖2-b中的樣品6和7顏色稍深，與圖2-a中對(duì)應(yīng)的電泳結(jié)果一致。因?yàn)锽stDNA酶是一種Mg2+依賴性聚合酶，適量Mg2+濃度可促進(jìn)酶的反應(yīng)活性。由圖2可見(jiàn)，Mg2+濃度為2.4 mmol/L時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量最多，隨其濃度升高，DNA量反而下降。結(jié)果表明,25 μL體系中50 mmol/L MgSO4溶液最佳添加量為1.2 μL，即濃度為2.4 mmol/L，比胡元慶等[22]研究的3.6 mmol/L Mg2+濃度略低，比紀(jì)懿芳等[23]研究的4.0 mmol/L Mg2+濃度也低。

a-Mg2+濃度對(duì)LAMP影響的電泳結(jié)果；b-Mg2+濃度對(duì)LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～7-體系中Mg2+濃度分別為1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2 mmol/L圖2 Mg2+濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of Mg2+ concentration on LAMP reaction

2.2.2 優(yōu)化dNTPs濃度

dNTPs是LAMP擴(kuò)增產(chǎn)生DNA鏈的原料，其濃度與反應(yīng)的效率密切相關(guān)，決定產(chǎn)物的最終合成量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)LAMP反應(yīng)體系中0.64～1.76 mmol/L遞增濃度的dNTPs進(jìn)行考察。由圖3-a可知，除了陰性對(duì)照管無(wú)階梯狀條帶，其余所有濃度dNTPs均產(chǎn)生了階梯狀條帶；最清晰的dNTPs濃度為0.96 mmol/L。SYBR Green Ⅰ檢測(cè)結(jié)果如圖3-b所示，橘黃色對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照反應(yīng)管，熒光綠為所有實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)管。

a-dNTPs濃度對(duì)LAMP影響的電泳結(jié)果；b-dNTPs濃度對(duì)LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～9-體系中dNTPs濃度分別為0.64、0.8、0.96、1.12、1.28、1.44、1.6和1.76 mmol/L圖3 dNTPs濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of dNTPs concentration on LAMP reaction

由于dNTP能與游離的Mg2+結(jié)合，在LAMP體系中過(guò)量時(shí)可以間接影響B(tài)stDNA酶的活性。所以圖3-a中樣品8的dNTP濃度為1.6 mmol/L，DNA合成量明顯下降。綜上所述，0.96 mmol/L的dNTPs為25 μL體系中的最佳濃度，與胡元慶等[22]篩選的最佳dNTPs條件一致，但比紀(jì)懿芳等[23]研究的3.5 mmol/L dNTPs濃度低很多。

2.2.3 優(yōu)化BstDNA聚合酶量

BstDNA聚合酶是LAMP反應(yīng)的催化劑，可直接影響擴(kuò)增效率。本實(shí)驗(yàn)考察了BstDNA聚合酶用量對(duì)LAMP反應(yīng)的影響。如圖4-a所示，酶的用量為0和1.6 U時(shí)無(wú)階梯狀條帶出現(xiàn)；3.2 U時(shí)開(kāi)始產(chǎn)生階梯狀條帶，4.8 U時(shí)產(chǎn)生最清晰條帶，繼續(xù)增加酶用量至6.4 U產(chǎn)物量無(wú)顯著增加，當(dāng)達(dá)到8 U時(shí)產(chǎn)物量反而下降。分析原因可能是高濃度的酶量會(huì)增加引物多聚體之間發(fā)生錯(cuò)配的幾率，影響LAMP擴(kuò)增的效率。如圖4-b所示，橘黃色對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照管和BstDNA聚合酶量為0和1.6 U時(shí)反應(yīng)管，其余反應(yīng)液均為綠色，而樣品7顏色稍深，與高酶量時(shí)擴(kuò)增效率下降有關(guān)。另外BstDNA聚合酶用量直接決定檢測(cè)成本。綜上所述，4.8 U為25 μL體系中BstDNA聚合酶(8 U/μL)的最佳用量，與胡元慶等[22]篩選的最佳酶量條件一致。

a-Bst DNA聚合酶用量對(duì)LAMP影響的電泳結(jié)果；b-Bst DNA聚合酶用量對(duì)LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～7-體系中Bst DNA聚合酶量分別為0、1.6、3.2、4.8、6.4和8 U圖4 Bst DNA聚合酶量對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of the amount of Bst DNA polymerase on LAMP reaction

2.2.4 優(yōu)化內(nèi)外引物濃度比

內(nèi)外引物濃度比是影響LAMP反應(yīng)特異性的重要條件。本實(shí)驗(yàn)考察內(nèi)外引物濃度比對(duì)LAMP反應(yīng)的影響。如圖5-a所示，所有濃度比都出現(xiàn)階梯狀條帶，當(dāng)內(nèi)外引物濃度比為8∶1時(shí)，階梯狀最清晰，繼續(xù)增加引物比DNA產(chǎn)量略有下降。如圖5-b所示，橘黃色對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照管反應(yīng)液，熒光綠色為實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液。LAMP反應(yīng)中內(nèi)引物不斷被消耗，而外引物量不會(huì)減少，所以內(nèi)外引物比越來(lái)越小，會(huì)抑制內(nèi)引物與靶序列配對(duì)，導(dǎo)致反應(yīng)不徹底。綜上所述,內(nèi)外引物濃度比8∶1為25 μL體系中最佳條件，與胡元慶等[22]和紀(jì)懿芳等[23]篩選的最佳引物比均一致。

a-內(nèi)外引物濃度比對(duì)LAMP影響的電泳結(jié)果；b-內(nèi)外引物濃度比對(duì)LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～6-體系中內(nèi)外引物濃度比分別為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1圖5 內(nèi)外引物濃度比對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of the ratio of primer concentration on LAMP reaction

2.2.5 優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間

LAMP相對(duì)于PCR擴(kuò)增技術(shù)而言，沒(méi)有升溫和降溫的過(guò)程，所以顯著節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP反應(yīng)的影響。由圖6-a可知，清晰的階梯狀條帶開(kāi)始產(chǎn)生的反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為40 min；反應(yīng)時(shí)間最短，產(chǎn)生亮度和清晰度最佳的階梯狀條帶的時(shí)長(zhǎng)為60 min。如圖6-b所示，橘黃色為陰性對(duì)照管反應(yīng)液，其余反應(yīng)液為熒光綠色。從時(shí)間優(yōu)化的結(jié)果分析，到達(dá)60 min時(shí)擴(kuò)增基本進(jìn)入平臺(tái)期，時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)并不能顯著增加DNA的產(chǎn)量，本著節(jié)約時(shí)間提高效率的原則，選擇60 min作為最佳條件，與胡元慶等[22]和紀(jì)懿芳等[23]篩選的最佳反應(yīng)時(shí)間均一致。

a-反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP影響的電泳結(jié)果；b-反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP影響的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～7-體系中反應(yīng)時(shí)間分別為20、30、40、50、60和70 min圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of reaction time on LAMP

2.2.6 優(yōu)化反應(yīng)溫度

LAMP是一種酶促反應(yīng)，溫度是控制酶活性的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)考察溫度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響。由圖7-a可知，在57～67 ℃時(shí)均有階梯狀條帶產(chǎn)生，當(dāng)反應(yīng)溫度為65 ℃時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰，溫度達(dá)到67 ℃時(shí)DNA產(chǎn)量略有下降。如圖7-b所示，橘黃色為陰性對(duì)照管反應(yīng)液，其余反應(yīng)液為熒光綠。BstDNA聚合酶最適反應(yīng)溫度是60～65 ℃，在此條件下酶兼具雙鏈解離與新鏈延伸的雙重活性，溫度過(guò)高可導(dǎo)致引物無(wú)法與目的片段有效結(jié)合而影響擴(kuò)增效率，溫度過(guò)低可使引物之間形成多聚體或者錯(cuò)配，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果表明，65 ℃為25 μL體系中最佳反應(yīng)溫度，比胡元慶等[22]篩選的最佳反應(yīng)溫度63 ℃稍高，與紀(jì)懿芳等[23]研究的最佳反應(yīng)溫度一致。

a-反應(yīng)溫度對(duì)LAMP影響的電泳結(jié)果；b-反應(yīng)溫度對(duì)LAMP影響的SYBR Green I染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～7-體系中反應(yīng)時(shí)間分別為57、59、61、63、65和67 ℃圖7 反應(yīng)溫度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on LAMP

2.3 特異性結(jié)果

特異性是評(píng)價(jià)LAMP反應(yīng)可靠性的重要指標(biāo)。結(jié)果如圖8-a所示，階梯狀條帶產(chǎn)生的為副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802，其余5株非副溶血弧菌均未出現(xiàn)階梯狀條帶。如圖8-b所示，用SYBR Green Ⅰ檢測(cè)，反應(yīng)液熒光綠的為溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組，其余5株非副溶血弧菌反應(yīng)液為橘黃色。影響LAMP特異性的因素很多，其中引物序列、內(nèi)外引物比和BstDNA聚合酶用量直接影響特異性，而Mg2+濃度、dNTPs濃度、反應(yīng)時(shí)間和溫度則間接影響特異性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上各因素確定了最佳條件后，用5種常見(jiàn)的食源性病原菌作對(duì)照分析LAMP方法檢測(cè)副溶血弧菌的特異性，為實(shí)際應(yīng)用于食品安全檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，用新的靶基因blaCARB-17建立的LAMP方法具有很好的特異性。

a-特異性實(shí)驗(yàn)的電泳結(jié)果；b-特異性實(shí)驗(yàn)的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1，7-副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC17802)；2～6-分別是大腸桿菌(Escherichia coli D5)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC26003)、沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis 50041)、志賀氏菌(Shigella B4)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes 54001)圖8 LAMP的特異性結(jié)果Fig.8 Results of LAMP specificity

2.4 靈敏性結(jié)果

LAMP反應(yīng)的靈敏性是評(píng)價(jià)其實(shí)效性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)用試劑盒提取了副溶血弧菌ATCC17802基因組，梯度稀釋后作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板分析其靈敏性。由圖9-a可知，當(dāng)基因組DNA質(zhì)量濃度為3.64×102ng/μL時(shí)，電泳圖顯示有梯狀條帶，質(zhì)量濃度繼續(xù)降低,條帶消失。SYBR Green I檢測(cè)結(jié)果如圖9-b所示，基因組質(zhì)量濃度為3.64×102ng/μL時(shí)反應(yīng)管顯示綠色，質(zhì)量濃度繼續(xù)降低綠色變淡。綜合電泳和染料顯色結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)所建立的LAMP方法的最低檢測(cè)限為3.64×102ng/μL，比紀(jì)懿芳等[23]研究的最低檢測(cè)限高。

a-靈敏性實(shí)驗(yàn)的電泳結(jié)果；b-靈敏性實(shí)驗(yàn)的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～11-副溶血弧菌ATCC17802的DNA質(zhì)量濃度依次為4.66×104、2.33×104、1.17×104、5.82×103、2.91×103、1.46×103、7.28×102、3.64×102、1.82×102和9.09×101 ng/μL圖9 LAMP的靈敏性結(jié)果Fig.9 Results of LAMP sensitivity

2.5 人工污染蝦樣品LAMP結(jié)果

副溶血弧菌ATCC17802的菌液梯度稀釋后，涂于新鮮蝦體表進(jìn)行污染模擬。如圖10-a所示，所有污染菌液的樣品均有階梯狀條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照未出現(xiàn)階梯狀；用SYBR Green I染色檢測(cè)的結(jié)果如圖10-b所示，除了陰性對(duì)照管所有反應(yīng)管變?yōu)榫G色。

a-LAMP檢測(cè)人工污染蝦樣品電泳結(jié)果；b-LAMP檢測(cè)人工污染蝦樣品的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～8-副溶血弧菌ATCC17802的菌液濃度依次為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101 CFU/mL圖10 人工污染蝦樣品的LAMP結(jié)果Fig.10 Results of LAMP for detecting experimentally inoculated shrimp samples

結(jié)果表明：人工污染模擬實(shí)驗(yàn)得到最低檢測(cè)限為10 CFU/mL，略高于胡元慶等[22]報(bào)道的1 CFU/mL，比紀(jì)懿芳等[23]的模擬實(shí)驗(yàn)中最低檢測(cè)限2.8×102CFU/mL略低。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

用針對(duì)tlh基因的PCR技術(shù)在450 bp處出現(xiàn)單條帶(圖略)，鑒定副溶血弧菌分離株共33株；對(duì)33個(gè)陽(yáng)性樣品(編號(hào)2～34)進(jìn)行LAMP檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為階梯狀條帶，如圖11-a所示；用SYBR Green I檢測(cè)結(jié)果如圖11-b所示，反應(yīng)液(編號(hào)2～34)均顯示熒光綠色。以上結(jié)果表明，建立的LAMP與tlh基因的PCR方法符合率100%。

a-LAMP檢測(cè)實(shí)際樣品實(shí)驗(yàn)的電泳結(jié)果；b-LAMP檢測(cè)實(shí)際樣品實(shí)驗(yàn)的SYBR Green Ⅰ染色結(jié)果；M-Trans?2K Plus Ⅱ DNA Marker；1-陰性對(duì)照；2～34-實(shí)際樣品圖11 LAMP檢測(cè)實(shí)際樣品結(jié)果Fig.11 Results of LAMP for detecting aquatic products

3 討論

副溶血弧菌是河口和海洋環(huán)境的常駐菌，目前已成為水產(chǎn)食源性人類(lèi)腸炎的主要病原[1]。該菌每年導(dǎo)致全球約50%-70%的腹瀉型腸炎病例，且引發(fā)的食物中毒事件越發(fā)頻繁[5]。從各種水產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)境都能分離到該菌，且對(duì)鏈霉素、頭孢類(lèi)和氨芐等抗生素表現(xiàn)高度耐藥性[3]。沿海地區(qū)的多重耐藥性在各種抗生素壓力環(huán)境中不斷演化[5]。副溶血弧菌對(duì)食品安全的威脅包括食物中毒、環(huán)境帶菌和多重耐藥3個(gè)方面。為防控該菌的傳播及變異，快速檢測(cè)是最有效的手段。

LAMP技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、易操作、不需要特殊擴(kuò)增設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)[12]。LAMP沒(méi)有常規(guī)PCR的升溫和降溫循環(huán)，在恒溫箱或水浴鍋中63～65 ℃反應(yīng)約30～60 min即得足量產(chǎn)物，更適合現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)[14]。分子診斷技術(shù)需要純化的DNA為模板，制備高純度DNA既耗時(shí)又費(fèi)錢(qián)，而LAMP可用粗提的DNA為模板。LAMP在結(jié)果分析方面有明顯優(yōu)勢(shì)，可用多種技術(shù)檢測(cè)產(chǎn)物，包括瓊脂糖凝膠電泳、肉眼可視化觀察、使用濁度計(jì)[29]。

本文對(duì)影響LAMP特異性與靈敏性的主要條件逐一進(jìn)行了優(yōu)化。其中BstDNA聚合酶用量、Mg2+濃度和反應(yīng)溫度通過(guò)影響B(tài)stDNA聚合酶的活性而作用于催化反應(yīng)，是LAMP的關(guān)鍵條件。BstDNA酶是LAMP反應(yīng)中的重要因素，適當(dāng)酶量可以保證反應(yīng)順利進(jìn)行，高濃度會(huì)使引物形成多聚體而降低反應(yīng)效率[12]。Mg2+可對(duì)BstDNA聚合酶的活性產(chǎn)生影響，高濃度的Mg2+不僅增加反應(yīng)的成本，還會(huì)導(dǎo)致體系的不穩(wěn)定[23]。LAMP反應(yīng)中Mg2+濃度有一個(gè)最佳條件，過(guò)多或過(guò)少都可能沒(méi)有結(jié)果。溫度是通過(guò)控制酶活性而影響LAMP反應(yīng)[15]，溫度過(guò)高會(huì)使引物與目的片段結(jié)合效率降低，溫度過(guò)低可使引物形成多聚體而出現(xiàn)假陽(yáng)性。內(nèi)引物在LAMP反應(yīng)中是決定因素，率先與靶序列互補(bǔ)配對(duì)，在BstDNA聚合酶作用下啟動(dòng)鏈延伸[12]。而外引物遵循自由碰撞理論與靶序列配對(duì)，高濃度能提升其錨定靶基因的效率，為內(nèi)引物的延伸提供骨架。適當(dāng)濃度的dNTPs是擴(kuò)增反應(yīng)的原料保障，實(shí)驗(yàn)中不宜過(guò)量，因?yàn)榈蜐舛鹊膁NTP可減少非靶位啟動(dòng)和延伸時(shí)的核苷酸錯(cuò)誤摻入[23]。LAMP相對(duì)于常規(guī)PCR和定量PCR技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是省時(shí)高效，一般反應(yīng)在60 min內(nèi)完成，借助染料或與流動(dòng)試紙條(lateral flow dipstick, LFD)技術(shù)聯(lián)用可在1 h內(nèi)得到結(jié)果。為確定新建立LAMP方法的可靠性，我們用新鮮蝦為宿主進(jìn)行了模擬實(shí)驗(yàn)，得到了最低檢測(cè)限為10 CFU/mL，為實(shí)際推廣應(yīng)用提供參考。為進(jìn)一步驗(yàn)證LAMP的可靠性，本實(shí)驗(yàn)收集了144份水產(chǎn)樣品，微生物分離后用PCR技術(shù)鑒定陽(yáng)性菌株，用LAMP技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也證明所建方法實(shí)用可靠。

特異性是LAMP檢測(cè)技術(shù)的重要指標(biāo)。本研究首次以副溶血弧菌的一種β內(nèi)酰胺酶編碼基因blaCARB-17為靶序列建立LAMP。特異性實(shí)驗(yàn)表明，本方法能特異性擴(kuò)增副溶血弧菌ATCC17802的blaCARB-17基因，未檢出其他5個(gè)對(duì)照食源性細(xì)菌。blaCARB-17基因在探索副溶血弧菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制時(shí)被發(fā)現(xiàn)，其位于基因組的2號(hào)染色體上，該基因的上游和下游分布相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶編碼基因[27]。blaCARB-17基因無(wú)法定位于任何基因島上，其遺傳環(huán)境中沒(méi)有整合酶和轉(zhuǎn)座酶等元件，表明該基因是副溶血弧菌的固有序列。2016年，LI等[28]基于blaCARB-17基因建立了檢測(cè)副溶血弧菌的PCR方法，特異性達(dá)到100%，而用tlh和atpA的PCR檢測(cè)有假陽(yáng)性，充分證明該基因是副溶血弧菌新的特異性靶序列。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者建立了檢測(cè)副溶血弧菌的多種LAMP方法，包括常規(guī)LAMP和LAMP與其他技術(shù)聯(lián)用，但均未能對(duì)實(shí)際樣品現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)性檢測(cè)[29]。常規(guī)LAMP比其他技術(shù)更實(shí)用，影響因素較少。本研究首次以blaCARB-17為靶序列建立常規(guī)LAMP方法，為深入探索其可視化試劑盒提供依據(jù)。

靈敏度是檢測(cè)技術(shù)的另一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)得到基因組最低檢測(cè)限為3.64×102ng/μL，模擬實(shí)驗(yàn)的菌落最低檢測(cè)限為10 CFU/mL。胡元慶等[22]建立了基于tlh基因的LAMP方法，最低檢測(cè)限為1 CFU/mL；紀(jì)懿芳等[23]建立了以tlh為標(biāo)識(shí)基因的LAMP方法，最低檢測(cè)限為140 CFU/mL；周順等[25]建立了以ompA為靶基因的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的雙重LAMP，對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)的靈敏度可達(dá)374～410 CFU/g (mL)；相興偉等[26]建立了針對(duì)副溶血弧菌toxR和霍亂弧菌ompW基因的雙重LAMP，對(duì)模擬食品樣品的最低檢測(cè)限為50 CFU/mL。通過(guò)以上對(duì)比可知,本研究建立的LAMP檢測(cè)限低于其他報(bào)道，可以用于水產(chǎn)食品的實(shí)際檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)副溶血弧菌blaCARB-17基因在線設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用BstDNA聚合酶擴(kuò)增β內(nèi)酰胺酶基因，對(duì)反應(yīng)體系中各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了Mg2+的最適濃度為2.4 mmol/L，dNTPs的最佳反應(yīng)濃度為0.96 mmol/L，BstDNA聚合酶最適用量為4.8 U，最佳內(nèi)外引物濃度比是8∶1，最佳反應(yīng)溫度是65 ℃，最佳反應(yīng)時(shí)間60 min，首次以blaCARB-17為目標(biāo)序列建立了檢測(cè)副溶血弧菌LAMP技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，以單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌為對(duì)照考察了LAMP的特異性，結(jié)果顯示只有副溶血弧菌LAMP反應(yīng)呈陽(yáng)性，其他對(duì)照菌株為陰性，表明該方法具有很好的特異性。通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品的檢測(cè)，都能說(shuō)明該LAMP方法具有很好的可靠性。當(dāng)然本研究還有一些可以改進(jìn)的方面，比如用羥基萘酚藍(lán)染料[29]代替SYBR Green I實(shí)現(xiàn)可視化，反應(yīng)前加入可避免操作過(guò)程中形成氣溶膠導(dǎo)致樣品交叉污染。還可以用付世騫等[30]設(shè)計(jì)的無(wú)電加熱器替代水浴鍋，便于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。綜上所述，本研究為探索基于blaCARB-17基因的LAMP試劑盒產(chǎn)品提供可能。