河豚魚皮膠原肽螯合鋅的組成與急性毒性研究

郭洪輝，陳暉，俞云，方華，陳思謹(jǐn)，洪專*

1(自然資源部第三海洋研究所 海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門，361005)2(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京，210023)

我國是水產(chǎn)加工和消費(fèi)大國，水產(chǎn)品總量約占世界總產(chǎn)量的1/3，生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的魚副產(chǎn)物，如魚皮、魚骨、魚鱗、魚頭、內(nèi)臟、碎肉等，約占原料魚的50%[1]。這些魚副產(chǎn)物中含有豐富的膠原蛋白，是良好的天然蛋白質(zhì)來源，如果直接廢棄，不僅浪費(fèi)資源還會增加環(huán)境的壓力[2]。目前，已有越來越多的研究關(guān)注從魚副產(chǎn)物中提取膠原蛋白、膠原肽并加以開發(fā)利用，提高水產(chǎn)加工高值化利用率[3-4]。

水產(chǎn)源膠原蛋白不同于傳統(tǒng)工業(yè)牲畜類膠原蛋白，往往具有更高的食用安全性[5]。當(dāng)與鈣、鋅、鐵等微量元素形成螯合物后，可更好地促進(jìn)微量元素在人體內(nèi)的吸收利用[6-7]，緩解微量元素缺乏所引起的并發(fā)癥。此外，螯合物還具有抗氧化、抗菌、增強(qiáng)免疫力、降血脂和降血糖等活性，有良好的開發(fā)應(yīng)用前景[8]。

多肽-金屬元素螯合物屬于新型的有機(jī)金屬螯合物，盡管構(gòu)成螯合物的微量元素和多肽都是可食用和安全的，但是也有必要對其毒理學(xué)安全性進(jìn)行科學(xué)評估[9]。過量的微量元素攝入會對機(jī)體產(chǎn)生危害，如帶魚蛋白亞鐵螯合肽在高劑量組會出現(xiàn)試驗(yàn)小鼠死亡[10]，通過急性毒性試驗(yàn)得到其半數(shù)致死量(lethal dose 50%,LD50)為7.454 8 g/kg。蛋氨酸鋅在急性毒性試驗(yàn)期間，高劑量組大鼠全部死亡; 中劑量組大鼠出現(xiàn)部分死亡，測得蛋氨酸鋅的LD50值為2.000 g/kg，屬于低毒級別[11]。目前關(guān)于多肽-金屬螯合物的安全性評價數(shù)據(jù)仍比較缺乏，本研究對河豚魚皮中提取的膠原多肽與鋅的螯合物進(jìn)行了組成成分分析，并根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，對其毒理學(xué)安全性進(jìn)行初步評價，為河豚魚皮膠原肽螯合鋅的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚魚皮膠原肽(CP)、河豚魚皮膠原肽螯合鋅(CP-Zn)，實(shí)驗(yàn)室自制[12]；Superdex peptide10/300GL凝膠色譜柱,美國GE 公司；氨基酸分析柱AminoPacPA10 (2 mm×250 mm)、保護(hù)柱AminoPacPA10 (2 mm×50 mm)，美國賽默飛世爾科技公司; ICR小鼠(體重18～20 g，實(shí)驗(yàn)動物合格證號SCXK (滬) 2013-0006)，上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司；標(biāo)準(zhǔn)氨基酸、標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品,Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 成分測定

水分含量：直接干燥法(GB/T 5009.3—2010)?；曳趾浚厚R弗爐灰化法 (GB/T 5009.4—2010)。粗蛋白含量：微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2016)。鋅含量：原子吸收光譜法(GB/T 5009.14—2017)。

1.3.2 膠原肽分子質(zhì)量的測定

1.3.3 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS) 檢測

將1 μL 10 mg/mL的樣品水溶液與1 μL基質(zhì) [20 mg 2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB)溶解于1 mL的體積分?jǐn)?shù)50%乙腈-水溶液中]混勻后，滴于不銹鋼靶上，室溫自然干燥，推入離子源中測定[14]。質(zhì)譜條件:所用激光為337 nm N2激光光源，激光脈沖3 ns, 加速電壓19.0 kV，反射電壓15.4 kV。譜圖采集模式為正離子反射模式，每張譜圖累計600次。

1.3.4 氨基酸組成檢測

稱取0.1 g樣品，用10 mL的6 mol/L的鹽酸消化完全后，稀釋200倍，用0.44 μm的濾膜過濾備用。采用離子色譜對樣品的氨基酸組成進(jìn)行分析[15]，以1 mol/L醋酸鈉、250 mmol/L NaOH水溶液為流動相，進(jìn)樣量10 μL,測定樣品的氨基酸組成和含量。

1.3.5 急性毒性試驗(yàn)

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，找出0%、100%動物死亡量后，取健康ICR小鼠50只，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半。隨機(jī)分為5組，每組10只，各組的河豚魚皮膠原肽螯合鋅(CP-Zn)的劑量為4.513 5、5.506 8、6.723 8、8.209 8、10.024 2 g/kg。給藥前，實(shí)驗(yàn)小鼠分籠，全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫20～25 ℃，實(shí)驗(yàn)室相對濕度60%～70%。試驗(yàn)前禁食(不禁水)12 h，各組分別按上述劑量一次灌胃給藥10 mL/kg。觀察14 d內(nèi)動物所發(fā)生異常反應(yīng)、死亡情況及死亡原因，未死亡動物于2周后處死進(jìn)行尸檢。

1.3.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析

由表1可知，CP的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(92.00±1.20)%，在與鋅離子螯合后，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降為(82.04±0.68)%，含鋅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(12.86±1.24)%，其蛋白質(zhì)和鋅的含量相對較高，說明CP與鋅離子有較強(qiáng)的結(jié)合能力[16]。

表1 CP和CP-Zn的主要組成成分Table 1 Main composition of CP and CP-Zn

2.2 分子質(zhì)量分析

采用凝膠色譜對CP和CP-Zn的分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定，如圖1所示。圖1-a是5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子質(zhì)量分布圖，按照出峰順序，從左到右分別為細(xì)胞色素 C (M=12 384)、抑肽酶 (M=6 512)、桿菌肽 A (M=1 422)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸 (M=189)、甘氨酸(M=75)。采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量的對數(shù)值對洗脫體積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：lgM=-0.23V+6.490 2 (R2=0.991 1)。通過洗脫體積可計算樣品的分子質(zhì)量分布。由圖1-b和圖1-c可知，CP的分子質(zhì)量組成處在標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量的低段，主要集中在1 000 Da以內(nèi)，為小分子的膠原肽，峰值位置為16.1 mL，其分子質(zhì)量在600 Da附近。從出峰位置判斷，CP-Zn的分子質(zhì)量范圍明顯要大于CP的分子質(zhì)量，分子質(zhì)量分布在200～3 000 Da，峰值位置為14.3 mL，通過回歸方程可估算其所在的分子質(zhì)量約為1 500 Da。圖2是CP和CP-Zn的MALDI-TOF 質(zhì)譜圖，通過質(zhì)譜圖可以對CP和CP-Zn的分子質(zhì)量做進(jìn)一步的判斷。譜圖中的縱坐標(biāo)為離子豐度，橫坐標(biāo)為離子的質(zhì)荷比。經(jīng)MALDI-TOF 質(zhì)譜儀測定CP的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+均小于1200, 即CP的相對分子質(zhì)量主要在1 200 Da內(nèi)，這與凝膠色譜的測定結(jié)果較為吻合[17]。圖2-a所示，CP的主峰為質(zhì)荷比643.243 的離子，對應(yīng)為[M +H]+，而與鋅離子形成螯合物后，在CP-Zn的質(zhì)譜圖中，形成了一個電荷的質(zhì)荷比為707.404 的特征峰，對應(yīng)為[M-H+Zn]+。對比得出，多肽[M+H]+結(jié)合一個鋅變?yōu)橘|(zhì)荷比為707.404 的峰[M-H+Zn]+，這也表明了多肽螯合鋅的生成[18]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白(a), CP(b)和CP-Zn(c)的分子質(zhì)量分布Fig.1 Molecular weight distribution of standard proteins(a), CP(b) and CP-Zn(c)

圖2 CP(a)和CP-Zn(b)的MALDI-TOF 質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI-TOF mass spectra of CP (a) and CP-Zn(b)

2.3 氨基酸組成分析

CP和CP-Zn的氨基酸組成及比例測定結(jié)果如表2所示。CP和CP-Zn中均能檢測出18種氨基酸，其中含量較高的氨基酸分別為甘氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。CP中的甘氨酸含量為12.28%，羥脯氨酸的含量為21.65%，占總氨基酸的比例分別為13.67%和24.09%，與Zn2+螯合后，此2種氨基酸的含量也是較為豐富，這基本符合膠原蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)[19]。但是從分析結(jié)果上看，河豚魚皮膠原肽中含有豐富的酸性氨基酸，其中天冬氨酸的比例最高為26.16%，谷氨酸為9.27%，與鋅螯合后，其比例均有所增加。由于酸性氨基酸側(cè)鏈的羧基具有較強(qiáng)的金屬結(jié)合能力，因此天冬氨酸和谷氨酸的羧基很可能成為CP與Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)[20-21]。CP中總的氨基酸含量為89.86%，而CP-Zn中的氨基酸總含量顯著下降，為81.44%, 這是由于CP-Zn中含有大量的鋅離子所致[16]。

表2 CP和CP-Zn的氨基酸組成及比例Table 2 Amino acid composition and proportion of CP and CP-Zn

2.4 急性毒性試驗(yàn)

給予小鼠CP-Zn后，觀察并記錄小鼠體質(zhì)量變化以及各組小鼠的死亡數(shù)。由表3可知，在觀察期間，小鼠的體質(zhì)量均有明顯增長，但是隨著給藥劑量的增加，小鼠體質(zhì)量的總增加量呈減少的趨勢。按不同劑量給藥的各組小鼠，除4.513 5 g/kg劑量組外均開始有動物死亡(表4)，而高劑量組(10.024 2 g/kg)的小鼠在給藥后出現(xiàn)活動減少等癥狀并全部死亡；劑量組5.506 8 ～8.209 8 g/kg也出現(xiàn)小鼠不同程度的死亡，給藥劑量增大，小鼠的死亡數(shù)也增多。4.513 5 g/kg劑量組的小鼠表現(xiàn)正常。對各劑量組死亡的小鼠及時尸檢，肉眼未見心、肝、脾、肺、腎等臟器的異常改變。各組連續(xù)觀察14 d，計算各組動物死亡總數(shù)，按Bliss法計算小鼠的LD50及其95%的可信限，得出CP-Zn的LD50為6.847 9 g/kg，95%的可信限為6.122 4～7.676 5 g/kg。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版) 中的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，LD50在5.001～15.000 g/kg為實(shí)際無毒級別，因此CP-Zn的急性毒性屬于實(shí)際無毒。對比補(bǔ)鋅劑ZnSO4的LD50為0.583 2 g/kg[22]，乳酸鋅的LD50為0.977～1.778 g/kg[23]，蛋氨酸鋅的LD50值為2.00 g/kg[11]，葡萄糖酸鋅的LD50值為2.50 g/kg[24]，L-賴氨酸鋅的LD50值為3.512 4 mg/kg[25]，可看出有機(jī)鋅的毒副作用明顯較無機(jī)鋅小，而CP-Zn的LD50值較大，說明其具有更高的食用安全性，適合進(jìn)一步開發(fā)用于鋅補(bǔ)充劑。

表3 CP-Zn對小鼠體重的影響Table 3 Effect of CP-Zn on body weight of mice

表4 CP-Zn的小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Acute oral toxicity test of CP-Zn on mice

3 結(jié)論

從河豚魚皮中提取制備膠原肽，并與鋅螯合得到河豚魚皮膠原肽螯合鋅。河豚魚皮膠原肽的分子質(zhì)量基本在1 000 Da以下，主要集中在600 Da附近，為小分子的膠原寡肽，其蛋白質(zhì)含量為(92.00±1.20)%。氨基酸組成分析顯示，河豚魚皮膠原肽富含甘氨酸、羥脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。河豚魚皮膠原肽螯合鋅的分子質(zhì)量分布范圍明顯要大于膠原肽，其蛋白含量為(82.04%±0.68)%，鋅含量為(12.86±1.24)%，MALDI-TOF 質(zhì)譜圖可以說明肽-鋅螯合物的生成。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，河豚魚皮膠原肽螯合鋅的LD50為6.847 9 g/kg，95%的可信限為6.122 4～7.676 5 g/kg，屬于實(shí)際無毒級，與傳統(tǒng)補(bǔ)鋅劑ZnSO4、葡萄糖酸鋅相比，具有更高的食用安全性，有望進(jìn)一步開發(fā)河豚魚皮膠原肽螯合鋅在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。