鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1抗幽門螺桿菌感染的臨床效果評價

張美怡，翟齊嘯，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)感染是消化性胃潰瘍、慢性胃炎甚至胃癌等多種消化道疾病的主要致病因素。全球范圍內(nèi)H.pylori的感染率超過50%，且發(fā)展中國家的感染率(70%～90%)遠高于發(fā)達國家(25%～50%)[1-2]。目前，國內(nèi)外主要采用三聯(lián)和四聯(lián)療法作為H.pylori的治療方案。但由于抗生素的廣泛使用，H.pylori的耐藥性、治療過程中的不良反應(yīng)、胃腸功能紊亂等問題一直存在[3-4]。因此，尋求非抗生素物質(zhì)來治療或輔助治療H.pylori感染十分重要。研究顯示，益生菌、生物活性蛋白、抗氧化劑、植物提取物等膳食成分具有完善或改進現(xiàn)有治療方案的作用效果[5]。

諸多研究表明鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和羅伊氏乳桿菌等具有降低H.pylori感染的功效[6-8]。鼠李糖乳桿菌LGG可以體外抑制H.pylori生長，輔助三聯(lián)治療可以提高臨床H.pylori的根除率[9]。本實驗室前期從江蘇省昆山市健康人糞便篩選到1株鼠李糖乳桿菌，其在體外模擬的胃液和腸液中處理后的存活率可以達到86.89%，且其抗生素抗性較低，是1株具有較好體外特性的潛力菌株。

本研究擬探究鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1(鼠李糖乳桿菌CCFM1119)抗H.pylori感染的效果，首先通過其抑制H.pylori生長和黏附作用進行體外評價，再通過臨床實驗進一步探究其緩解患者H.pylori感染的作用效果，以期開發(fā)一種用于干預治療H.pylori感染的食療性乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株和細胞株

LGG來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)，其他乳桿菌是從中國健康人糞便分離并保藏于江南大學食品生物技術(shù)中心菌種保藏庫；H.pyloriSS1受贈于南方醫(yī)科大學陳燁教授團隊；人胃腺癌細胞(human gastric adenocarcinoma cell line，AGS)購買自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑

哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，英國OXOID公司；脫纖維綿羊血，杭州新銳公司；F-12培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Gibco公司；尿素，江蘇博美達生命科學公司；苯酚紅，國藥集團化學試劑公司；人胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒，南京福麥斯公司。

1.1.3 主要設(shè)備

PB300-N電子天平，上海Mettler Toledo公司；HWS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；i160三氣培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；MLS-3 750高壓蒸汽滅菌鍋，日本SANYO公司；BSC-1 000ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳桿菌抑菌能力的測定

參考RYAN等[10]的方法。乳桿菌活化2代，菌懸液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾，得到乳桿菌發(fā)酵上清液。活化2代的H.pylori菌懸液調(diào)整為108CFU/mL，取100 μL涂布于哥倫比亞血平板，牛津杯中加入150 μL乳桿菌發(fā)酵上清液。正置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測定抑菌圈直徑，每個樣本做3個平行實驗。

1.2.2 乳桿菌抑制H.pylori粘附能力的測定

實驗參考PASTENE等[11]的方法。AGS細胞接種于96孔板(2×104個/孔)過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁后以感染復數(shù)100加入F-12重懸的H.pylori和乳桿菌分別共培養(yǎng)2 h，再加入200 μL尿素酶試劑培養(yǎng)3 h，測定550 nm波長的吸光值，每個樣本做6個平行實驗。

1.2.3 臨床受試者選擇標準

招募受試者為通過13C/14C呼氣試驗(urea breath test，UBT)、快速尿素酶或組織學檢查，于入組3個月內(nèi)診斷為H.pylori感染，且既往未進行抗H.pylori治療的患者。若患者在納入研究前的1個月內(nèi)服用了抗生素或乳桿菌產(chǎn)品、既往有胃腸道手術(shù)史、有歷史性的嚴重疾病或者精神疾病將被排除在外。

1.2.4 臨床實驗設(shè)計

本研究于2019年在江蘇省鹽城市亭湖區(qū)人民醫(yī)院開展，研究通過了倫理審核(編號：ET2019033)，并注冊于中國臨床試驗注冊中心(注冊號：ChiCTR1900024938)。實驗招募了26名H.pylori陽性患者，通過隨機序列將受試者隨機分為2組，即安慰劑和鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1組?；颊呙刻煸缤?次服用菌粉(5×109CFU/g，2 g/包)或安慰劑產(chǎn)品，為期1個月。

1.2.5 臨床檢測指標

1.2.5.114C呼氣值的測定

受試者在實驗開始前1 d和結(jié)束后1 d通過14C呼氣檢測儀測定呼氣值。

1.2.5.2 胃腸癥狀評分的測定

參考SVEDLUND等[12]設(shè)計的胃腸癥狀評分量表(gastrointestinal symptom rating scale，GSRS)，分別于實驗開始前1天與結(jié)束后1天填寫。

1.2.5.3 PG水平的測定

2次體檢均收集受試者的血液樣品，離心后取血清。具體的測定方法參照ELISA試劑盒進行。

1.2.5.4 免疫因子水平的測定

血清中IL-8和TNF-α水平的測定參照ELISA試劑盒進行。

1.2.5.5 腸道菌群的測定

實驗結(jié)束后收集受試者糞便樣品提取糞便DNA，參考MAO等[13]的方法PCR擴增細菌16S rDNA的V3～V4區(qū)，純化后以等質(zhì)量濃度混合構(gòu)建基因文庫，通過Illumina MiSeq 測序儀上機測序。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1抑制H. pylori生長及黏附的作用效果

乳桿菌抑制H.pylori生長和黏附是目前測定乳桿菌體外抑菌效果的主要指標。除鼠李糖乳桿菌492外，其他幾株鼠李糖乳桿菌都可以抑制H.pylori生長，其中JS-SZ-2-1的抑菌圈達到了12.92 mm，與陽性菌株LGG抑菌效果類似。然而將乳桿菌上清液pH調(diào)至7.00后，所有乳桿菌均未出現(xiàn)抑菌圈，說明乳桿菌抑制H.pylori生長主要是酸或酸依賴性成分的作用[14]。與此同時，鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1處理后H.pylori對AGS的黏附率顯著下降。研究報道乳桿菌抑制黏附可能與乳桿菌的空間位阻作用[15]或其對黏附基因表達的抑制作用[16]相關(guān)。鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1體外抗H.pylori感染的效果在這幾株菌中最優(yōu)。

表1 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1抑菌能力和降低H. pylori黏附AGS的能力Table 1 The antibacterial ability of L.rhamnosus JS-SZ-2-1 and ability to reduce adhesion of H. pylori to AGS

2.2 臨床實驗入組受試者基線信息

臨床實驗共招募了26名符合要求的H.pylori陽性患者，表2顯示了2組入組人群年齡、男女比例等基本信息，2組受試者基線情況無顯著性差異。

表2 入組受試者基線信息Table 2 Basic information of the enrolled population

2.3 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對受試者體內(nèi)H.pylori定殖量的影響

測定13C/14C量可以表征患者H.pylori的感染情況，13C/14C呼氣是診斷H.pylori感染最準確的無創(chuàng)方法[17-18]。由圖1可知，安慰劑組呼氣值前后無變化，而鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1組患者的呼氣值顯著降低(△UBT 1.82 vs 106.00)。臨床定義14C表征H.pylori感染的臨界值為100，呼氣值<100即可認為不存在H.pylori感染。從表3可知，服用乳桿菌1個月后，鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1組患者的根除率與安慰劑組相比顯著提高(61.54% vs 15.38%，P<0.05)。CRUCHET等[19]證明服用4周約氏乳桿菌La1后H.pylori的清除率達到40%，與本研究結(jié)果相似，而LEE等[20]發(fā)現(xiàn)服用4周混合菌株后患者的H.pylori并未清除，這一結(jié)果可能是由菌株特異性所導致。人體胃部pH較低，胃酸會殺死大部分經(jīng)口進入胃部的細菌，而鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1具有較強的耐酸性，且其發(fā)酵液中含有抑制H.pylori的物質(zhì)，還可以阻礙H.pylori黏附于胃黏膜，故可降低患者胃內(nèi)H.pylori定殖，從而緩解H.pylori感染，提高患者根除率。

圖1 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對患者呼氣降低值的影響Fig.1 Reduction in value of UBT with the supplementation of L.rhamnosus JS-SZ-2-1注：*表示2組間存在顯著性差異，P<0.05

表3 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對H.pylori的根除率的影響Table 3 Effect of L.rhamnosus JS-SZ-2-1 on the eradication rate of H.pylori

2.4 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1緩解GSRS的作用效果

GSRS是臨床患者胃腸癥狀嚴重程度和頻率的重要指標，評分越低則癥狀越輕。2組治療前GSRS均在6.00以上，組間無顯著性差異。服用乳桿菌1個月后，安慰劑組GSRS無變化(5.15±1.35)，而JS-SZ-2-1組評分降至2.27，癥狀顯著改善。實驗結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1具有改善胃腸癥狀的作用，這可能與食用乳桿菌后H.pylori定殖量的減少有關(guān)。FRANCAVILLA等[21]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌ATCC 55730有類似的作用效果。

圖2 各組干預后GSRS的變化情況Fig.2 The comparison of GSRS after intervention between groups注：ns表示2組間無顯著性差異，*表示2組間存在顯著性差異，P<0.05

2.5 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對血清PG水平的影響

不同病變階段，血清PG的含量不同，其反映胃黏膜分泌功能的強弱，進一步反映胃黏膜狀態(tài)[22]。在本研究中，2組治療前PGⅠ/PGⅡ的水平均在6.50左右。乳桿菌干預1個月后，PGⅠ/PGⅡ比值均增高到7.50以上，但2組治療前后比值的變化并無顯著差異性，即鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對患者血清PG水平無顯著影響。FRANCAVILLA等[23]的研究結(jié)果與本研究相似，而IGARASHI等[24]的研究指出攝入格氏乳桿菌會增加PGⅠ水平。然而目前尚未有文獻報道乳桿菌影響PG水平的具體機制，這一方面需要進一步的研究。

表4 各組治療后患者血清PG水平的變化情況Table 4 Levels of PG in patients after treatment between groups

2.6 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對血清炎癥因子水平的影響

研究表明，H.pylori感染后70%以上的人都會出現(xiàn)無癥狀的慢性活動性胃炎[25]，H.pylori會刺激機體產(chǎn)生多種細胞因子(如IL-8和TNF-α)，并進一步引發(fā)炎癥。本研究治療前2組的IL-8和TNF-α水平均在11～13 ng/L，組間差異不顯著。乳桿菌干預1個月后，2組IL-8和TNF-α的水平均無顯著變化(P>0.05)，即鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對調(diào)節(jié)H.pylori感染患者免疫反應(yīng)的效果不明顯。乳桿菌具有降低H.pylori毒力因子表達，調(diào)節(jié)機體免疫等作用，然而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)因菌株特異性而不盡相同[26]。

表5 各組治療后免疫因子水平的變化情況Table 5 Levels of immune factors after treatment between groups

2.7 鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1對受試者腸道菌群的影響

H.pylori感染會引起體內(nèi)多處菌群的改變，綜合考慮采樣的可操作性和方便性，本研究以腸道菌群為代表探究乳桿菌干預后對胃下游微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用。

乳桿菌干預后，乳桿菌組與安慰劑的Shannon指數(shù)(圖3-a)無明顯差異，這說明乳桿菌干預并不會影響腸道菌群的α多樣性。圖3-b顯示的2組聚集區(qū)域相互重疊，說明乳桿菌干預對菌群的β多樣性影響也不大。

乳桿菌干預1個月后，兩組受試者腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)無明顯變化。在屬水平上，相較于安慰劑組，Lactobacillus豐度無變化，Parasutterella和Lachnospir-aceaeNK4A136 group豐度降低，ErysipelotrichaceaeUCG-003豐度升高。Parasutterella與慢性功能性胃腸疾病的發(fā)展有關(guān)[27]，LachnospiraceaeNK4A136 group與代謝相關(guān)[28]，其豐度的降低對胃腸癥狀的改善可能有積極作用，而ErysipelotrichaceaeUCG-003在健康老年人腸道數(shù)量較多，有助于降低非健康老化的風險[29]。以上結(jié)果說明，鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1干預后對腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用，這可能是其改善胃腸癥狀的一個重要因素。

a-菌群α多樣性；b-菌群β多樣性圖3 腸道菌群多樣性Fig.3 Diversity of gut microbiota

a-腸道菌群門水平組成；b-腸道菌群屬水平組成；c-Lactobacillus相對豐度；d-Parasutterella相對豐度；e-Lachnospiraceae NK4A136 group相對豐度；f-Erysipelotrichaceae UCG-003相對豐度圖4 腸道菌群組成分析Fig.4 Composition of gut microbiota注：*表示與安慰劑組相比存在顯著性差異，P<0.05

3 結(jié)論

鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1體外抑制H.pylori生長能力和降低其對AGS的黏附作用效果顯著。在臨床試驗中，鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-顯著降低了受試者14C呼氣值(△UBT=106)和GSRS評分，調(diào)節(jié)了患者的腸道菌群，然患者血清PG水平和IL-8、TNF-α免疫因子水平無明顯變化。綜上所述，鼠李糖乳桿菌JS-SZ-2-1能夠降低患者體內(nèi)H.pylori的定殖量，有效緩解H.pylori感染和其導致的胃腸癥狀，但對免疫調(diào)節(jié)的作用效果并不顯著。