皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)肌肉酶解產(chǎn)物制備及其免疫活性研究

任鼎鼎，黃夢怡，鄭惠娜,2,3,4*，曹文紅,2,3,4，林海生,2,3,4，秦小明,2,3,4，章超樺,2,3,4

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088)2(廣東海洋大學 深圳研究院，廣東 深圳，518108)3(國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東 湛江，524088)4(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心(大連工業(yè)大學)，遼寧 大連，116034)

皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)，又稱“腹魚”，屬于軟體動物門的單殼貝類[1]。2018年中國的鮑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量為163 169 t，比2017年增長9.85%，主要分布在廣東、福建、山東等地區(qū)[2-3]。鮑魚肉質(zhì)鮮美，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸和維生素種類齊全，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值[4-5]。然而，目前除部分鮮銷外，多數(shù)以干制品及罐頭制品等粗加工產(chǎn)品為主[6-7]，高附加值、精深加工制品較少，缺乏相關(guān)的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

生物酶解法是提高蛋白質(zhì)高值化利用的重要手段。目前，國內(nèi)外利用生物酶解法制備具有各種生物活性的酶解產(chǎn)物的相關(guān)研究很多。如張帥等[8]采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶水解的河蜆肉酶解產(chǎn)物對乙醇脫氫酶具有激活作用，可延長小鼠的醉酒時間以及縮短醒酒時間，由此得出河蜆水解蛋白肽具有解酒護肝的功效。LEE等[9]采用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等對金槍魚進行水解，并分離鑒定出具有較高抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的多肽。JANG等[10]采用堿性蛋白酶進行水解，并用超濾、高效液相色譜以及反相高效液相色譜進行分離純化，得到抗氧化肽，且質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率達到90%。LI等[11]從牡蠣酶解液中分離純化得到具有免疫調(diào)節(jié)的短肽，能夠促進巨噬細胞的增殖和吞噬能力，誘導NO、腫瘤壞死因子α、白細胞介素-6的產(chǎn)生。因此，以海洋蛋白資源為底物，利用生物酶解技術(shù)開發(fā)具有各種生物活性功能的多肽制品對促進海洋蛋白資源高值化利用具有重要的意義。目前，鮑魚肌肉酶解產(chǎn)物相關(guān)研究主要集中在抗氧化[12]、抗腫瘤[13]等生物活性方面，鮑魚肌肉免疫活性的研究未見報道。

生物活性肽免疫活性的評價主要通過動物模型來實現(xiàn)，目前以小鼠、大鼠等哺乳動物較為廣泛[14-15]，但存在用量大、價格高等缺陷。斑馬魚作為一種新型的動物模型，具有體積小、易生長、用量小等優(yōu)勢[16]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在癌癥[17]、神經(jīng)疾病[18]、代謝疾病[19]、免疫活性[20]等方面。

本文采用動物蛋白酶和風味蛋白酶為水解酶，以皺紋盤鮑肌肉為原料，優(yōu)選最佳酶解時間，進一步采用斑馬魚動物實驗?zāi)Ｐ停接戸U魚肌肉酶解產(chǎn)物以及超濾組分對斑馬魚免疫活性的影響，為開發(fā)鮑魚生物功能制品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)11～12月購買于湛江市霞山區(qū)東風批發(fā)市場，規(guī)格70 g左右；斑馬魚(35 日齡)，上海佳譽水族館；動物蛋白酶(9.8×104U/g)、風味蛋白酶(6.8×104U/g)，食品級，廣西南寧龐博生物工程有限公司；斑馬魚溶菌酶(lysozyme, LYS)Elisa試劑盒、斑馬魚堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)Elisa試劑盒、斑馬魚免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)Elisa試劑盒，江蘇酶免實業(yè)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司等；

LPG-5高速離心噴霧干燥機，常州蘇正干燥設(shè)備有限公司；DW-86L338 J超低溫冰箱，青島海爾特種儀器有限公司；DHG-9240A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；電子調(diào)溫萬用爐(一聯(lián))，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計，日本島津公司；3-550PD馬弗爐，美國VULCAN公司；K-424凱氏定氮消化爐，瑞士Buchi公司；B324凱氏定氮蒸餾器，瑞士Buchi公司；GR22GII高速冷凍離心機，日立工機株式公社；Mini Pellicon超濾系統(tǒng)，Merck Millipore 有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將新鮮鮑魚去除殼和內(nèi)臟,采用質(zhì)量濃度120 g/L NaCl溶液攪拌清洗20 min，去除表面黑漬后,每袋500 g貯存于-20 ℃，備用。

1.2.2 鮑魚酶解工藝優(yōu)化

根據(jù)參考文獻[21]稍作修改。將新鮮鮑魚肌肉洗凈瀝干，分別稱取5份(每份1 kg)于錐形瓶，按質(zhì)量濃度0.333 g/L加入提前預(yù)冷的蒸餾水，自然條件(pH 6.8)下按原料質(zhì)量的0.3%分別加入動物蛋白酶和風味蛋白酶，于53 ℃恒溫搖床中分別酶解1、2、3、4和5 h(每隔1 h取出1份)，100 ℃中滅酶10 min，迅速冷卻后，于4 ℃，6 000 r/min離心20 min去除雜質(zhì)，收集上清液后繼續(xù)于4 ℃，4 000 r/min離心20 min去除部分油脂，然后各取50 mL酶解液進行水解度(degree of hydrolysis，DH)和蛋白回收率的測定，確定最佳酶解時間。將酶解1、2、3、4和5 h后剩余的鮑魚酶解液(abalone enzymatic hydrolysis of peptides，AHP)進行噴霧干燥，以鮑魚酶解粉1(AHP-1)、鮑魚酶解粉2(AHP-2)、鮑魚酶解粉3(AHP-3)、鮑魚酶解粉4(AHP-4)和鮑魚酶解粉5(AHP-5)為樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同干燥方式酶解產(chǎn)物的制備

在最佳酶解時間下按上述操作制備冷凍干燥鮑魚多肽(FD-AHP)樣品和噴霧干燥鮑魚多肽(SD-AHP)樣品；同時將酶解液超濾，得到>10 kDa、5 k～10 kDa、<5 kDa組分，-45 ℃下冷凍干燥后備用。

1.2.4 一般營養(yǎng)成分分析

水分測定用直接干燥法(GB 5009.3—2016)[22]；脂肪測定用索氏抽提法(GB 5009.6—2016)[23]；灰分測定用高溫灼燒法(GB 5009.4—2016)[24]；總糖測定用硫酸-苯酚法(GB/T 9695.31—2008)[25]；蛋白質(zhì)測定用凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)[26]。

1.2.5 蛋白回收率和DH測定

采用凱氏定氮法[26]測定AHP上清液和原料中的蛋白含量，按公式(1)計算蛋白回收率：

(1)

采用凱氏定氮法測定總氮及非蛋白氮含量[26]，甲醛滴定法測定α-氨基態(tài)氮[27]，按公式(2)計算DH：

(2)

式中：w1，酶解液中的α-氨基態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)，%；w2，原料中的α-氨基態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)，%；w3，總氮質(zhì)量分數(shù)，%；w4，非蛋白氮質(zhì)量分數(shù)，%。

1.2.6 斑馬魚模型建立

健康的35日齡斑馬魚，共684條，平均體質(zhì)量(45±5) mg，體長1.5～2 cm，共19組(每組12 條，3次平行)。實驗中用空氣石進行恒定通氣，溫度為(25.2±0.8) ℃，pH為(7.6±0.3)，溶解氧范圍為(7.22±0.19) mg/L。前14 d的適應(yīng)期用空白組(NC)喂養(yǎng)，一日2次喂魚，每日所需量按每箱魚的總質(zhì)量的15 g/kg進行換算，每隔2周進行1次稱重，持續(xù)8周[28]。將FD-AHP、SD-AHP、>10 kDa、5 k～10 kDa、<5 kDa組分分別以質(zhì)量分數(shù)為1%、2%和3%噴灑在飼料上，將其充分混勻制備飼料[29]，同時用鹽酸左旋咪挫為陽性組(PC)作對照實驗。

1.2.7 免疫活性相關(guān)指標測定

1.2.7.1 魚勻漿液的制備

實驗周期結(jié)束后，將斑馬魚撈出置于冰塊中致暈，除去頭部和鰭。取1 g樣品加9 mL 0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)，用手動勻漿器充分勻漿。懸浮液于4 ℃下4 000 r/min離心15 min，收集上清液進行LYS活性、ALP活性以及IgG含量等指標的測定[30]。

1.2.7.2 LYS活性測定

根據(jù)LYS Elisa試劑盒操在450 nm處測定標準曲線及樣品活性；其中標準曲線回歸方程為y=0.006 7x+0.050 1，R2=0.998 1。

1.2.7.3 ALP活性測定

根據(jù)ALP Elisa試劑盒在450 nm處測定標準曲線及樣品活性；其中標準曲線回歸方程為y=0.009x+0.007 1，R2=0.998 1。

1.2.7.4 IgG含量測定

根據(jù)IgG Elisa試劑盒說明，在450 nm處測定標準曲線及樣品活性，其中標準曲線回歸方程為y=0.044 8x+0.049 1，R2=0.999 6；用BCA法測定總蛋白濃度，其中標準曲線回歸方程為y=0.044 8x+0.049 1，R2=0.999 6，根據(jù)試劑盒樣品的說明，測定后按公式(3)計算IgG含量：

(3)

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解時間制備的酶解產(chǎn)物基本營養(yǎng)成分分析

為確定最佳酶解時間，本研究分析了不同酶解時間制備的酶解產(chǎn)物基本營養(yǎng)成分，結(jié)果見表1。以干基計，鮑魚酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量均較高，最高可達(88.92±2.10)%；脂肪含量較低，最高僅達到(0.13±0.01)%；總糖含量最高達到(17.46±0.88)%。鮑魚酶解產(chǎn)物的蛋白含量均高于河蜆[8]、牡蠣[21]等。由此可以看出，鮑魚酶解產(chǎn)物是一種高蛋白的優(yōu)質(zhì)海洋食品。同時，不同酶解時間的酶解產(chǎn)物營養(yǎng)成分差異性不顯著。

表1 新鮮鮑魚、酶解產(chǎn)物基本營養(yǎng)成分組成比較 單位：%

2.2 酶解時間對酶解產(chǎn)物DH及蛋白回收率的影響

不同酶解時間的DH及蛋白回收率見圖1。隨著酶解時間的增加，DH及蛋白回收率呈不斷增加的趨勢，在1～4 h內(nèi)，DH及蛋白回收率增長較快；而酶解4 h后增長較緩，5 h的酶解產(chǎn)物與4 h酶解產(chǎn)物的DH和蛋白回收率均無顯著性差異(P>0.05), 此結(jié)果與張華丹等[31]研究結(jié)果一致?？赡苁且驗槊附? h之內(nèi)，底物與酶的質(zhì)量濃度較高，接觸面積較大，酶解速率較高，隨著時間的增加，肽被酶解成更小的氨基酸導致短肽含量減少，同時酶活力下降，蛋白回收率增長緩慢[32]。因此，從生產(chǎn)經(jīng)濟成本考慮選擇鮑魚酶解產(chǎn)物的最佳酶解時間為4 h。

圖1 不同時間酶解產(chǎn)物的DH及蛋白回收率比較Fig.1 Comparison of DH and protein recovery of enzymatic hydrolysis products at different hydrolyzing times注：不同字母表示樣品之間有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 鮑魚酶解產(chǎn)物免疫活性

2.3.1 鮑魚酶解產(chǎn)物及超濾組分對LYS活性的影響

LYS是一種富含宿主血清的抗菌酶，其活性是體液免疫和先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可以在機體內(nèi)催化水解細菌細胞壁溶解死亡，增強巨噬細胞的吞噬功能和消化能力，從而起到免疫防御的作用[33]。圖2-a顯示，在不同干燥方式的酶解產(chǎn)物中，各處理組的LYS活性均高于NC組。同時發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)FD-AHP組的LYS活性較強，且FD-AHP 1%的效果最好，達到(166.04±23.48)U/L，與NC、PC相比，具有顯著性差異(P<0.05)；同時將FD-AHP 1%與NC、PC組對比發(fā)現(xiàn)，均具有極顯著差異(P<0.01)。而喂養(yǎng)SD-AHP組的LYS活性低于FD-AHP組，最低為(113.62±30.48)U/L，可能是由于溫度過高，在一定程度上造成了活性成分的損失，而冷凍干燥溫度較低，保護了營養(yǎng)成分。在FD-AHP 1%、2%、3%中喂養(yǎng)1% FD-AHP組的LYS活性較強，明顯高于2%和3%組可能是因為劑量提高對斑馬魚蛋白消化利用率降低有關(guān)[34]。

圖2-b顯示，在超濾組分中，喂養(yǎng)<5 kDa組的LYS活性較強，但各劑量之間沒有顯著性差異(P>0.05)。研究結(jié)果顯示喂養(yǎng)<5 kDa 2%組的LYS活性最高，達到(1 481.29±160.70)U/L，將喂養(yǎng)<5 kDa 2%組與NC、PC組兩兩對比，均具有極顯著差異(P<0.01)，說明在各處理組中，喂養(yǎng)<5 kDa的斑馬魚的LYS活性最強，可能是因為<5 kDa酶解超濾產(chǎn)物含有更多增強LYS活性的營養(yǎng)物質(zhì)[35]，同時有研究發(fā)現(xiàn)一定程度的營養(yǎng)物質(zhì)(如蛋氨酸等)可以顯著提高LYS活性[36]。由此可以看出，鮑魚酶解產(chǎn)物可提高斑馬魚LYS活性，且冷凍干燥組分以及<5kDa超濾組分活性更強。然而，相關(guān)研究表明，多糖飼養(yǎng)后在一定程度上也能提高魚類的LYS活性[37]，樣品中有效組分相關(guān)作用有待進一步研究。

a-干燥方式；b-超濾組分圖2 鮑魚酶解產(chǎn)物干燥方式及超濾組分對LYS活性的影響Fig.2 Effect of drying mode and ultrafiltration component of abalone on LYS activity注： FD-AHP1%冷凍干燥酶解產(chǎn)物劑量為1%，F(xiàn)D-AHP 2%冷凍干燥酶解產(chǎn)物劑量為2%；FD-AHP 3%冷凍干燥酶解組分劑量為3%；SD-AHP 1%噴霧干燥酶解產(chǎn)物劑量為1%；SD-AHP 2%噴霧干燥酶解產(chǎn)物劑量為2%；SD-AHP 3%噴霧干燥酶解產(chǎn)物劑量為3%。*表示兩兩對比的顯著性差異(P<0.05)；**表示兩兩對比的極顯著差異(P<0.01)(圖3～4同)

2.3.2 鮑魚酶解產(chǎn)物及超濾組分對ALP活性的影響

ALP是生物體內(nèi)一種重要的磷酸單脂酶，可催化磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，參與蛋白質(zhì)的合成，同時因其水解活性而具有抗菌性能，可以改善免疫功能，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[38]。圖3-a顯示，各處理組均能提高斑馬魚的ALP活性；但喂養(yǎng)FD-AHP組的ALP活性較強，且喂養(yǎng)1% FD-AHP組的ALP活性最高，達到(7.46±1.02)IU/L；同時將喂養(yǎng)FD-AHP 1%組與NC、PC組比較發(fā)現(xiàn)，均具有極顯著性差異(P<0.01)。這進一步說明，冷凍干燥能夠更好地保留樣品的活性避免由于高溫而造成活性喪失[39]。

圖3-b顯示，在不同超濾組分中，喂養(yǎng)<5 kDa樣品組的ALP活性整體較好，且喂養(yǎng)<5 kDa 2%樣品組的ALP活性最高，達到(1 617.39±206.70I)U/L；將喂養(yǎng)<5 kDa 2%樣品組與NC、PC組進行比較，均具有極顯著差異(P<0.01)?？赡苁且驗?5 kDa超濾組分的相對分子質(zhì)量較小，更有利于斑馬魚的消化吸收[40]，同時<5 kDa超濾組分具有提高ALP活性的成分，可能與一些微量元素有關(guān)[41]。相關(guān)研究表明，多糖飼養(yǎng)后有提高血清中堿性磷酸酶活性以及上調(diào)免疫因子的作用[42]。數(shù)據(jù)表明，鮑魚酶解產(chǎn)物可以提高斑馬魚ALP活性，同時可以看出冷凍干燥組分以及<5 kDa超濾組分活性較好。

a-干燥方式；b-超濾組分圖3 鮑魚酶解產(chǎn)物干燥方式及超濾組分對ALP活性的影響Fig.3 Effect of drying mode and ultrafiltration component of abalone on ALP activity

2.3.3 鮑魚酶解產(chǎn)物及超濾組分對IgG含量的影響

IgG是一類重要的免疫效應(yīng)因子，主要存在于血液和組織分泌液中，可以中和毒素并阻止病原體的侵入，減少病毒對機體的傷害，還可以形成免疫系統(tǒng)從而提高免疫力[43]。圖4-a顯示，IgG含量不具有規(guī)律性，除喂養(yǎng)3%FD-AHP樣品組的IgG含量較低[(0.17±0.02)μg/mg]，其余組分均可以提高IgG含量。喂養(yǎng)1% FD-AHP組分達到最大值，為(0.31±0.09)μg/mg；而將1%FD-AHP組與NC組對比發(fā)現(xiàn)，具有顯著性差異(P<0.05)，而與PC組對比發(fā)現(xiàn)，不具有顯著性差異(P>0.05)。同時，冷凍干燥樣品組隨著劑量的提高，IgG含量逐漸下降，這可能與斑馬魚自身的生理功能以及對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率有關(guān)，蛋白含量的增加造成斑馬魚消化負擔過重，未能充分消化利用[44]。而在SD-AHP組分中隨著劑量的增加，IgG含量先降低后升高，3%劑量效果最好，達到(0.31±0.04)μg/mg?？赡苁且驗镮gG主要分布在血清和組織中，鮑魚酶解產(chǎn)物刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而分泌免疫球蛋白；而噴霧干燥較冷凍干燥具有良好的溶解性，斑馬魚在水體環(huán)境中通過組織吸收一部分，從而影響斑馬魚的免疫系統(tǒng)，因此噴霧干燥較冷凍干燥更易增加IgG含量[45]。

a-干燥方式；b-超濾組分圖4 鮑魚酶解產(chǎn)物干燥方式及超濾組分對IgG含量的影響Fig.4 Effect of drying mode and ultrafiltration component of abalone on IgG concentration

圖4-b顯示，在超濾組分中，喂養(yǎng)>10 kDa 3%、5 k～10 kDa 1%和<5 kDa 2%組分與NC相比，具有顯著性差異(P<0.05)，但3者之間并沒有顯著性差異(P>0.05)，且喂養(yǎng)5 k～10 kDa 1%樣品組的IgG含量最高，達到(34.77±2.40)μg/mg，同時與NC組進行比較，具有顯著性差異(P<0.05)；與PC組對比發(fā)現(xiàn)，具有極顯著差異(P<0.01)；這可能是5 k～10 kDa組分中含有較多能提高IgG免疫的活性物質(zhì)，而劑量的提高反而導致IgG含量下降，這可能與斑馬魚對鮑魚蛋白的消化吸收利用率有關(guān)，也可能與魚自身的性質(zhì)、生理功能和腸道功能等多種因素有關(guān)[46]。然而，從研究結(jié)果可以看出，斑馬魚IgG含量變化與樣品劑量關(guān)系不明顯，這有待進一步研究。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，無論是冷凍干燥還是噴霧干燥制備的AHP均可以提高斑馬魚的免疫活性。與噴霧干燥制備的AHP對比，采用冷凍干燥方式制備的AHP免疫活性較強。在各超濾組分中，<5 kDa超濾組分的免疫活性較強，研究結(jié)果為AHP開發(fā)生物功能營養(yǎng)健康食品提供參考數(shù)據(jù)。