DNA 甲基化與COPD 關系的研究進展

祁亞楠，尚茜，齊詠,★

（1.鄭州大學人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州；2.河南省人民呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州）

0 引言

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一個日益嚴重的全球性健康問題，直接影響著3億多人，是世界上第三大死亡原因[1]。同時，由于缺乏有效的治療策略，導致醫(yī)療成本巨大，成為主要的公共衛(wèi)生負擔[2]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，隨著全基因測序技術(shù)的發(fā)展和甲基化芯片技術(shù)的出現(xiàn)，大量研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與COPD相關[3]。在不影響DNA序列的情況下，遺傳和環(huán)境因素均可通過調(diào)控基因的DNA甲基化來影響DNA片段的活性，從而調(diào)控基因表達，參與COPD的病理生理過程。

1 DNA 甲基化概述

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將一個甲基基團加到胞嘧啶殘基的5’端，可逆地修飾DNA結(jié)構(gòu)而不改變DNA序列，通過影響DNA片段的活性調(diào)控基因表達的過程。DNA序列中富含GC的CpG二核苷酸簇被稱為CpG島，通?；騿幼訁^(qū)域中CpG島的DNA甲基化會導致基因沉默，而甲基化不足會觸發(fā)轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控基因表達。與基因啟動子區(qū)域相反，基因體中的DNA甲基化常與DNA轉(zhuǎn)錄增強相關[4]。

2 COPD 與 DNA 甲基化

COPD是一種進行性肺部疾病，與年齡和吸煙有關，由于慢性支氣管炎和肺氣腫導致不可逆轉(zhuǎn)的氣流受限。其特征在于不可逆的氣流受限，通常是漸進性的，并伴隨著呼吸道和肺部對有害顆?；驓怏w（特別是香煙煙霧）的慢性炎癥反應[5]。COPD的發(fā)病機制包括彈性蛋白酶-抗彈性蛋白酶假說、慢性炎癥、氧化劑-抗氧化劑的失衡、細胞凋亡和無效修復等，吸煙是其主要環(huán)境危險因素。DNA甲基化是連接環(huán)境與遺傳基礎的橋梁，穿插在COPD的各個發(fā)病機制之中介導基因表達[6]。已有較多證據(jù)表明COPD的存在和嚴重程度與DNA甲基化的異常表達有關[7-11]，DNA甲基化可能是COPD特異性基因表達改變的基礎，對 DNA 甲基化的深入研究為COPD開發(fā)新的表觀遺傳治療干預措施提供機會。

2.1 肺功能與異常的DNA 甲基化

COPD 是一種氣道疾病，肺功能降低是其診斷的必備條件，肺功能檢查有助于 COPD 的診斷和病情評估。研究發(fā)現(xiàn)芳基烴受體阻遏基因(AHRR)cg05575921位點低甲基化與吸煙、肺功能低下、肺功能急劇下降和呼吸系統(tǒng)癥狀相關[12]。Kodal等人[13]對1991-1994年哥本哈根城市心臟隊列研究的9113個個體行外周血AHRR甲基化測定及肺功能檢查，于2001-2003年對其中4532個個體再次行外周血AHRR甲基化測定及肺功能檢查，橫斷面研究結(jié)果表明AHRR低甲基化與FVC、FEV1/FVC有關，前瞻性分析發(fā)現(xiàn)AHRR甲基化程度與FEV1/身高和FVC/身高有關，與FEV1/FVC(p=0.08)無關。IL6、IFNγ 具有促炎和抗炎的雙重作用，可能通過激活負反饋發(fā)揮作用，其基因的低甲基化與FEV1升高相關[14]。

在兩個關于COPD的研究隊列中，Qiu等人[15]通過Illumina27K陣列觀察到349個CpG位點的甲基化與COPD的存在和嚴重程度（是否存在 COPD、FEV1/FVC、FEV1）相關。349個CpG位點的基因（330個基因）分析表明，許多基因參與了免疫和炎癥反應、對壓力的反應、以及傷口愈合和凝血級聯(lián)反應等。其中與FEV1/FVC關聯(lián)最高的五位是SERPINA1、ATP6V1E2、FXYD1、TRPM2和LRP3基因的CpG位點，與FEV1關聯(lián)最高的五位是 SERPINA1、ATP6V1E2、FXYD1、FUT7和 STAT5A基因的CpG位點，其中SERPINA1基因的2個CpG位點cg02181506和cg24621042與 COPD、FEV1/FVC、FEV1均顯著相關。

與Qiu等人的研究不同，De Vries等人發(fā)現(xiàn)36個CpG位點甲基化水平與FEV1/FVC相關[16]，但與COPD的存在與否無關[17]，這兩項研究的結(jié)果不同，可能是因為這兩項研究均為非隨機橫斷面研究且納入標準不同，同時表明DNA甲基化研究是高度可變的。Bermingham等人[18]通過Illumina 850K陣列進一步確認了28個與是否存在COPD和呼吸功能特征（FEV1、FVC和FEV1/FVC）相關的差異甲基化修飾位點（DMS）,這些DMS位點被定位到參與選擇性剪接、JAK-STAT信號通路和軸突相關的基因上，具體作用機制尚不清楚。DNA甲基化未來有可能成為評估COPD存在、嚴重程度、肺功能及預后的生物標志物，為COPD的診斷及病情評估提供新的方法。

2.2 COPD 的發(fā)病機制與異常的DNA 甲基化

2.2.1 細胞凋亡

Notch1能通過抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路來減輕COPD患者香煙煙霧誘導的內(nèi)皮細胞凋亡[19]，ERK通路通過調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (mtTFA)啟動子的甲基化參與COPD的發(fā)生發(fā)展[20]。Qiu等人[21]通過對人支氣管上皮細胞和鼠肺泡巨噬細胞系的研究發(fā)現(xiàn)由Notch信號激活介導的Klotho甲基化可以通過增加炎癥反應和細胞凋亡來參與COPD的發(fā)病機制，因此未來Notch可作為COPD、抗衰老因子和抑癌劑的藥物作用靶點。

COPD患者肺泡巨噬細胞吞噬凋亡細胞的能力下降，并且該缺陷可能與鞘氨醇-1磷酸酯系統(tǒng)有關，特別是鞘氨醇-1-磷酸受體5（sphingosine-1-phosphate receptor 5，S1PR5）。為進一步研究COPD與S1PR5的關系，Barnawi等人[22]從COPD患者中分離出肺泡巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)COPD患者肺泡巨噬細胞S1PR5啟動子甲基化水平低于健康非吸煙者，與S1PR5的表達呈負相關。而體外培養(yǎng)的巨噬細胞經(jīng)甲基化抑制劑處理后吞噬能力增強，且增強程度與抑制劑劑量呈正相關。

2.2.2 氧化應激

既往研究表明DNA甲基化與香煙煙霧/氧化劑介導的肺部疾病有關[23]，氧化應激是吸煙誘導 C0PD 發(fā)病的重要機制之一。COPD的發(fā)生與肺中的主要抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)在氣道上皮細胞中的合成速率直接相關，谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）是GSH合成的限速酶的調(diào)節(jié)亞基，GCLC啟動子的高甲基化與COPD的發(fā)生發(fā)展相關。CHENG等人[24]發(fā)現(xiàn)與肺功能正常的前吸煙者和從不吸煙者組相比，當前吸煙者和COPD患者肺組織中GCLC啟動子的高甲基化，降低了GCLC mRNA的表達、血漿GSH水平。煙草提取物(cigarette smoke extract，CSE)誘導的人支氣管上皮細胞經(jīng)5-氮雜-2’-脫氧胞苷（AZA；脫甲基試劑）處理后GCLC的表達增高。Peng等人[19]在COPD患者肺組織、CSE處理的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）中發(fā)現(xiàn)mtTFA啟動子高甲基化、mtTFA mRNA和蛋白表達下降，而AZA可恢復CSE引起的HUVECs中mtTFA的表達。表明吸煙誘導的相關基因啟動子高甲基化可能與COPD的發(fā)生發(fā)展相關，未來可能通過開發(fā)去甲基化藥物為COPD的干預提供新的策略。

Vucic等人[25]對COPD患者及對照組的小氣道上皮的DNA和RNA進行了全基因組甲基化和基因表達檢測，通過富集分析，發(fā)現(xiàn)COPD患者DNA甲基化和基因表達水平顯著差異的3條通路：磷酸酶和張力蛋白同源物（PTEN）信號傳導通路、NF-E2相關因子2（Nrf2）信號通路以及IL-17炎癥反應通路，其中Nrf2信號傳導通路最顯著，有46個基因的甲基化差異表達。COPD患者PTEN通路中的PTEN和CSNK2A2基因高度甲基化、表達不足；Nrf2通路是抵抗氧化應激的主要細胞防御系統(tǒng)，該通路中的兩個基因EPHX1和CYP4F11是整體甲基化和表達改變最負相關的基因，COPD 患者 EPHX1 和 CYP4F11的表達降低；IL-17的過表達與許多炎癥性疾病有關，但其在COPD中的作用尚不明確，COPD患者該途徑中的上游受體IL17RC和下游受體CXCL1高甲基化且表達不足，促炎性CSF2基因低甲基化、過表達。

2.2.3 肺氣腫

DNA甲基化參與肺氣腫的病理生理過程。Yoo等人[26]確定了126個COPD的調(diào)節(jié)因子，其中EPAS1是唯一的關鍵調(diào)控因子,EPAS1是一種低氧反應性轉(zhuǎn)錄因子，也稱為低氧誘導因子2α，其下游基因與COPD疾病嚴重程度相關的多個基因組明顯重疊，包括缺氧應答基因和與肺氣腫嚴重程度相關的基因。與對照組相比，COPD患者肺組織中的EPAS1甲基化水平與疾病嚴重程度顯著相關，且 EPAS1蛋白表達降低。

干細胞抗原1（Sca-1）是一種小鼠糖基磷脂酰肌醇固定蛋白，是造血干細胞的細胞表面標記，也可以由非造血器官中的組織駐留干細胞和祖細胞表達，內(nèi)皮祖細胞是造血干細胞的一種亞型，通過歸巢在損傷部位促進內(nèi)皮修復。He等人[27]研究的結(jié)果表明，祖細胞池的消耗和Sca-1基因的甲基化可能與小鼠肺氣腫的發(fā)生發(fā)展有關,通過DNA甲基化抑制劑地西他濱可以抑制Sca-1基因的甲基化，增強肺組織和骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞中Sca-1的表達,部分保護小鼠免受CSE誘導的肺氣腫。另一項關于抗凋亡Bcl-2的實驗[28]支持DNA甲基化參與肺氣腫的發(fā)生，該實驗通過腹膜內(nèi)注射CSE建立小鼠的肺氣腫模型，發(fā)現(xiàn)CSE注射組肺細胞凋亡指數(shù)顯著高于對照組（（25.88±7.55）%VS（6.28±2.96）%）。與對照組小鼠相比，在CSE注射小鼠中觀察到Bcl-2啟動子高甲基化、Bcl-2表達降低，而通過AZA可使Bcl-2啟動子去甲基化、Bcl-2表達增強，減輕了CSE引起的肺細胞凋亡和功能衰竭。這表明抗凋亡的Bcl-2啟動子甲基化可能是CSE誘導的肺氣腫細胞凋亡增加的原因。

2.2.4 粘液高分泌

黏液分泌過多會增加COPD患者的發(fā)病率和死亡率，與杯狀細胞化生有關。杯狀細胞化生是由一個龐大的基因網(wǎng)絡決定的，是COPD的共同特征，轉(zhuǎn)錄因子SPDEF和FOXA2是杯狀細胞化生的兩個關鍵調(diào)控因子。Song等人[29]將COPD患者和對照組的氣道上皮細胞誘導分化為杯狀細胞，發(fā)現(xiàn)對照組氣道上皮細胞在IL-13誘導的杯狀細胞SPDEF啟動子CpG 8位點高甲基化、SPDEF表達增加，F(xiàn)OXA2低甲基化（CpG 14、15）、FOXA2表達降低；與對照組相比，在不存在IL-13的情況下COPD患者上皮細胞SPDEF啟動子CpG 6位點低甲基化、SPDEF表達增加，F(xiàn)OXA2低甲基化（CpG 10、11）而表達水平?jīng)]有變化。因此SPDEF和FOXA2的異常DNA甲基化可能是COPD粘液高分泌的潛在因素之一，為表觀遺傳學抑制粘液高分泌開辟了新的途徑。

2.3 COPD 表型與異常的DNA 甲基化

明確COPD表型的異質(zhì)性對個體化醫(yī)療的發(fā)展具有重要意義，而相關基因的DNA甲基化表達對COPD的分型具有積極作用。Lee等人[30]采用全基因組分析比較了24例急性加重期COPD患者與12例非COPD對照者外周血單核細胞甲基化水平，發(fā)現(xiàn)PRKAG2基因相關CpG位點在COPD患者和正常受試者中具有不同的甲基化水平，ALOX5AP基因相關CpG位點甲基化水平與對類固醇激素治療反應良好相關。PRKAG2是腺苷酸激活蛋白激酶的一個非催化亞基，腺苷酸激活蛋白激酶與COPD患者肌肉自噬增強有關[31]，ALOX5AP涉及白三烯的生物合成，是阻斷白三烯生成的藥物靶點，且ALOX5AP抑制劑已被應用于包括COPD在內(nèi)的炎性疾病的治療[32]。

Rosas-Alonso等人[33]通過甲基化特異性聚合酶鏈反應定量檢測COPD患者頰上皮miR-7甲基水平，發(fā)現(xiàn)肺氣腫表型COPD患者miR-7甲基化水平較高。未來有可能根據(jù)DNA甲基化標記，對COPD患者進行分型來指導COPD患者的治療，如對類固醇激素治療反應良好的COPD患者可認為是一個獨特的亞型。

2.4 其他

吸煙是COPD與肺癌共同的主要危險因素，兩種疾病之間存在密切的聯(lián)系[34]。Tessema等人[35]通過Illumina 450K陣列對非小細胞肺癌患者肺組織進行了表觀基因組關聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)與COPD相關的CCDC37和MAP1B表達降低可能導致這些基因高甲基化進而導致肺癌。腫瘤組織CCDC37和MAP1B的甲基化水平高于無癌肺組織，其中患有COPD的癌組織甲基化水平最高，且甲基化水平與CCDC37和MAP1B的表達呈負相關。與健康吸煙者相比，COPD患者的痰中CCDC37甲基化更為普遍，表明CCDC37和MAP1B的甲基化水平未來有可能成為預測COPD、肺癌發(fā)生的可能性的生物標志物。

Wielscher等人[36]通過臨床病例研究發(fā)現(xiàn)了COPD 患者cg05979020（HOXD10）、cg05964935（N/A）、cg05769349（TBX5）和cg10384245（ADCYAP1）高甲基化。Busch等人[37]發(fā)現(xiàn)與COPD相關性最高的五個位點甲基化百分比的平均差異為5.3%至9.6%，其中甲基化最高的差異位點是cg16361890，其定位于MAML1基因，其余4個位點的基因注釋為RBFOX2、CD72、GRASP和SH3TC1，與肺和氣道生理相關[37]。

不同細胞或不同部位的DNA甲基化水平不同。Amstrong等人[38]通過Illumina 850K陣列對上葉、下葉不同部位的肺泡巨噬細胞進行了全基因組DNA甲基化檢測，在95個CpG位點上觀察到顯著的甲基化差異，這些基因包括CLIP4、HSH2D、NR4A1、SNX10和TYK2，是炎癥、免疫相關生物學過程的參與者。CLIFFORD等人[39]分離出具有和不具有COPD的個體的氣道和實質(zhì)成纖維細胞，進行DNA 甲基化檢測，僅在實質(zhì)成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)差異DNA甲基化與差異基因表達相關。此外研究發(fā)現(xiàn)與非西班牙裔白人相比，非西班牙裔黑人的DNA甲基化水平明顯較低[40]，表明DNA甲基化因性別和種族/民族的不同而不同，DNA甲基化作為表觀遺傳標記時需要考慮地域、種族等這些變量。

3 存在的問題及展望

大量研究表明，DNA甲基化與COPD有關，但發(fā)表的數(shù)據(jù)缺乏一致性，可能與研究的異質(zhì)性有關如種族、研究設計、實驗室方法和統(tǒng)計分析等。此外，由于缺乏前瞻性研究數(shù)據(jù)，DNA甲基化是導致疾病的原因或疾病導致的結(jié)果有待商榷，需要進一步的前瞻性研究以固定時間間隔的進行DNA甲基化檢測，以評估疾病發(fā)生和甲基化的時間序列。

DNA甲基化是一種重要的基因組表觀修飾形式，在COPD發(fā)生發(fā)展的中起著關鍵作用。表觀遺傳藥物治療COPD的探索是一個巨大的研究領域，本領域的深入研究將進一步揭示COPD的病理生理，為COPD的診斷和治療提供新的靶點。