多囊卵巢綜合征患者HMGA2基因多態(tài)性與胰島素抵抗的相關(guān)性研究

王景娜，魏蕊霞，賈君

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第980醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性最常見的生殖內(nèi)分泌疾病，以高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變和稀發(fā)/無排卵為主要特征，常合并胰島素抵抗(IR)，導(dǎo)致一系列代謝異常，這與2型糖尿病的臨床表現(xiàn)相似。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(Genome-wide association study，GWAS)表明高遷移率族蛋白A2(high mobility group A2，HMGA2)為PCOS和2型糖尿病的共同易感基因[1-2]。HMGA2是一種非組蛋白染色體蛋白，本身并無轉(zhuǎn)錄活性，但可通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄[3]。研究表明，HMGA2可能參與調(diào)控卵巢高級(jí)別漿液性癌腫瘤細(xì)胞凋亡，且可能與卵巢上皮細(xì)胞癌的順鉑耐藥性有關(guān)[4-5]。Jiao等[6]研究顯示HMGA2基因的rs2272046位點(diǎn)的多態(tài)性與PCOS有關(guān)。目前未見有關(guān)于HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)多態(tài)性與PCOS患者IR相關(guān)性的研究。本研究對(duì)河北PCOS人群HMGA2基因多態(tài)性進(jìn)行分析，探討HMGA2多態(tài)性與PCOS臨床IR和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，為IR的發(fā)病機(jī)制提供研究思路。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2019年5月至2020年1月于本院就診的98例PCOS患者為研究對(duì)象。

98例PCOS患者(PCOS組)根據(jù)空腹胰島素水平是否升高或耐糖量是否下降再分為胰島素抵抗組(IR組，54例)和非胰島素抵抗組(NIR組，44例)兩個(gè)亞組。IR診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)空腹胰島素水平>15 mU/L；(2)根據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]診斷為糖耐量下降。符合該兩個(gè)條件之一即診斷為IR。

納入標(biāo)準(zhǔn)：PCOS診斷符合2003年鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；未伴有其它惡性腫瘤者；臨床資料保存完整者；漢族人群。

排除標(biāo)準(zhǔn)：陰道超聲檢查，子宮及卵巢發(fā)現(xiàn)有器質(zhì)性病變者；近3個(gè)月服用過激素類藥物者；伴有內(nèi)分泌、高血壓等疾病者；有糖尿病家族史。

另選取同期例因單純輸卵管因素或男性因素不孕在本院生殖中心門診就診的86例非PCOS不孕婦女作為對(duì)照(對(duì)照組)。

本研究中所有患者均由主治醫(yī)師明確診斷。本試驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象對(duì)本研究均知情并簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

核酸提取試劑盒和核酸自動(dòng)提取儀(廈門致善生物)；SYBRPremixExTaqTMII Kit(大連寶生物)；熒光定量PCR儀(QIAGEN，德國(guó))；PUZS-300自動(dòng)生化分析儀(上海帝博思生物科技)；Beckman Dxi800型全自動(dòng)免疫化學(xué)發(fā)光分析儀(Beckman，美國(guó))。

三、研究方法

1.樣品采集及保存：抽取所有受試者清晨空腹外周靜脈血(PCOS組月經(jīng)規(guī)律者在月經(jīng)周期的第3～5天，月經(jīng)不規(guī)律者在B超檢查未見優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí))，3 000 r/min離心15 min后收集血清，迅速置于-80℃保存待測(cè)，用于血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

2.血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定：采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖水平，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清LH、FSH、睪酮(T)、胰島素。穩(wěn)態(tài)模型IR指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

3.HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)SNP檢測(cè)：抽取受試者2 ml外周靜脈血，EDTA抗凝。采用核酸提取試劑盒提取外周血基因組DNA。PCR引物由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司合成。上游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTGCAC-3′；下游引物：5′-TATCTGTGCGTGTGACAGCGGCT-3′。熒光PCR反應(yīng)體系共20 μl：SYBRPremixExTaqTMII 10 μl，上下游引物各0.5 μl(10 μmol/L)，DNA 模板1.0 μl，ddH2O 8.0 μl。PCR程序?yàn)椋?5℃ 預(yù)變性 5 min；95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃終末延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線或瓊脂糖電泳驗(yàn)證，溶解曲線為整齊單一的特異峰或電泳條帶為單一條帶且條帶長(zhǎng)度符合，說明擴(kuò)增成功。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程公司測(cè)序，BLAST進(jìn)行測(cè)序結(jié)果比對(duì)，判讀基因型。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料及生殖激素水平比較

PCOS組與對(duì)照組間年齡、血清FSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；PCOS組體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、血清LH、T水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般資料及生殖激素水平比較(-±s)

二、Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

HMGA2在rs2272046位點(diǎn)上有3種基因型，分別為CC型、CA型、AA型。根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，對(duì)照組、PCOS組以及IR和NIR亞組HMGA2在rs2272046位點(diǎn)上的各基因型的期望值和觀測(cè)值符合Hardy-Weinberg平衡定律(P均>0.05)，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究具有代表性(表2)。

三、各組患者HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)基因型和基因頻率分布

對(duì)照組基因型中CC型(55.81%)最多，其次為CA型(37.21%)，AA型(6.98%)最少；PCOS組中CA、AA兩種基因型占比較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，且IR組中CA、AA兩種基因型占比較NIR組顯著升高(P<0.05)。IR組中的A等位基因頻率顯著高于NIR組，而C等位基因頻率顯著低于NIR組(P<0.05)(表3)。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表3 各組患者HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)基因型和基因頻率分布[n(%)]

四、IR組患者HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)不同基因型與血糖、胰島素等的關(guān)系

IR組患者CA型和AA型基因型空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平均顯著高于CC型患者(P<0.05)(表4)。

五、影響IR發(fā)生的多因素分析

將PCOS患者是否發(fā)生IR作為因變量，校正年齡、BMI、WHR、FSH、LH、T、空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR等混雜因素后，以HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)的三種基因型(CC型、CA型、AA型)為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示AA型基因型是影響IR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表5)。

表4 IR組患者HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)不同基因型與血糖、胰島素等的關(guān)系(-±s)

表5 影響IR發(fā)生的多因素分析

討 論

PCOS是一種復(fù)雜的、異質(zhì)性較高的多基因疾病，其發(fā)生受基因與環(huán)境共同作用的影響，其中IR是PCOS重要的病理生理變化之一，大約60%～70%的PCOS患者發(fā)生胰島素抵抗[10]，因此參與胰島素代謝的基因在PCOS患者IR的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。而臨床中PCOS的IR增加了高血壓、脂質(zhì)代謝異常等的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]，因此研究胰島素代謝相關(guān)基因，可能對(duì)疾病的預(yù)防有重要作用。

GWAS研究表明HGMA為PCOS的易感基因，HMGA2基因定位于12q14.3，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAEG)中有較強(qiáng)的遷移能力而得名。其編碼的蛋白可作為構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子，可結(jié)合并改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象從而調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄；參與多個(gè)生物學(xué)過程的調(diào)控，在胚胎發(fā)生中高度表達(dá)，在大多數(shù)成熟和分化組織中幾乎不表達(dá)[12-13]，通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。HMGA2的過度表達(dá)可誘導(dǎo)卵巢上皮細(xì)胞發(fā)生惡化性轉(zhuǎn)化，與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有文獻(xiàn)報(bào)道HMGA2能促進(jìn)PCOS患者的卵巢顆粒細(xì)胞增殖[14]。目前關(guān)于其基因多態(tài)性在PCOS中的研究報(bào)道較少[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，PCOS組的IR組患者中的A等位基因頻率明顯高于NIR患者，提示rs2272046 C/A位點(diǎn)多態(tài)性可能與PCOS患者發(fā)生IR有關(guān)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，發(fā)生IR的CA型及AA型基因型PCOS患者具有較高的空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR水平，進(jìn)一步提示患者體內(nèi)HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)基因型表達(dá)異常可能影響患者體內(nèi)血糖和胰島素調(diào)節(jié)機(jī)制，而此調(diào)節(jié)機(jī)制的改變可能成為PCOS患者發(fā)生IR的主要因素，與陳曦[17]的結(jié)論基本一致。本研究的二元Logistic回歸分析顯示基因型AA型是影響IR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步提示攜帶AA型基因型的PCOS患者可能更傾向于發(fā)生IR，推測(cè)HMGA2基因的rs2272046 A可能是PCOS患者罹患IR的易感等位基因。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，PCOS患者具有較高的BMI、WHR及LH等激素水平。朱文靜等[18]研究結(jié)果顯示，PCOS患者的BMI、WHR、LH及睪酮等水平均高于對(duì)照組，與本研究結(jié)果基本一致，提示部分肥胖患者可能導(dǎo)致PCOS的發(fā)生，進(jìn)而出現(xiàn)血脂水平異常，推測(cè)血脂水平進(jìn)一步影響患者體內(nèi)激素水平，導(dǎo)致這些疾病之間相互關(guān)聯(lián)、互相促進(jìn)[19]

綜上所述，HMGA2單核苷酸多態(tài)性與PCOS患者IR有一定相關(guān)性，其中CA型、AA型基因型可能與IR發(fā)生有關(guān)。該研究從基因?qū)用嫣接慞COS的發(fā)病機(jī)制，為今后PCOS的IR診療提供了新思路，但本研究存在一定的局限性：本研究為單個(gè)中心的臨床試驗(yàn)，此結(jié)果僅能解釋本地區(qū)HMGA2基因rs2272046位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與PCOS患者IR存在一定相關(guān)性。因此，將來需大規(guī)模、多中心的臨床研究來進(jìn)一步證實(shí)及闡述HMGA2單核苷酸多態(tài)性在PCOS發(fā)病中的作用機(jī)制。