γ-氨基丁酸的制備方法及其功能食品研究進(jìn)展

寧亞維，馬夢戈，楊正，侯琳琳，趙忠情，陳藝，王志新，賈英民

1(河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊，050018) 2(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京，100048)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，也稱γ-氨酪酸，分子式為C4H9NO2，相對分子質(zhì)量為103.12，由谷氨酸(glutamic acid，Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)催化而來。GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，如與GABA-A受體結(jié)合可以擴(kuò)張血管降低血壓[1]；可以增加神經(jīng)元細(xì)胞膜對Cl-的通透性，引起細(xì)胞超極化，產(chǎn)生突觸后抑制效應(yīng)，達(dá)到鎮(zhèn)靜神經(jīng)的效果。GABA通過促進(jìn)GABA神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,增加GABA能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目，緩解因GABA神經(jīng)元細(xì)胞減少導(dǎo)致的小鼠抑郁[2]。此外，GABA還可以調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白相關(guān)的功能活性，緩和阿爾茲海默癥[3]。近來發(fā)現(xiàn)GABA還具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、改善腦血栓、降低1型糖尿病等功能[4]。盡管GABA具有諸多功能性，但是人體內(nèi)GABA含量會(huì)隨著人的年齡以及外界環(huán)境壓力的增加而日益減少，因此在日常飲食中補(bǔ)充GABA對改善人體健康具有重要意義。

食品中的GABA可通過食品原料富集和外源添加2種方式強(qiáng)化。食品原料富集是指對含有GABA的食用性植物原料通過脅迫處理增加其體內(nèi)GABA合成量，即植物源富集法。外源添加分為微生物合成法和化學(xué)合成法。微生物合成法包括直接發(fā)酵生產(chǎn)法和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。化學(xué)合成法是以吡咯烷酮、丁內(nèi)酯、氯化亞砜等為原料通過化學(xué)反應(yīng)開環(huán)制得GABA。但是由于化學(xué)法存在成本因素限制、副反應(yīng)多及環(huán)境污染等局限性，因此目前主要通過綠色、安全的植物源富集法和微生物合成法制備GABA。隨著科技的發(fā)展，近來新興非加熱技術(shù)在植物源GABA富集方面也表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。本文簡要概述了GABA的生物合成機(jī)制，對GABA制備方法及其功能性食品的開發(fā)現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，并對其未來研究開發(fā)方向進(jìn)行了展望。

1 植物源GABA合成機(jī)制及富集方法

GABA廣泛分布于小麥、大豆、發(fā)芽糙米等多種植物中，但含量較低。通常植物受到外界因素刺激時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)自我防御機(jī)制，體內(nèi)GABA水平增加，以利于植物適應(yīng)外界環(huán)境變化，因此可以通過脅迫的方式提高植物原料中GABA的水平。

1.1 植物富集GABA的內(nèi)在機(jī)制

高等植物中GABA的富集主要包括2條途徑(如圖1所示)[5]，第一條是植物體內(nèi)GAD催化L-谷氨酸生成GABA，生成的GABA經(jīng)GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA transaminase,GABA-T)、琥珀酸半醛脫氫酶(succinate semialdehyde dehydrogenase,SSADH)催化生成進(jìn)入TCA循環(huán)的琥珀酸半醛(succinate semialdehyde,SSA)、琥珀酸，這些反應(yīng)和GAD催化反應(yīng)一起構(gòu)成GABA支路。其中，GAD、GABA-T和SSADH是該途經(jīng)重要的調(diào)控酶，激活GAD或抑制GABA-T、SSADH可提高GABA富集量。目前的研究多通過激活GAD富集GABA。第二條途徑是由二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)降解多胺中間產(chǎn)物(腐胺、亞精胺)生成，與第一條途經(jīng)相比，該途徑生成GABA較少，不是GABA富集生產(chǎn)的主要途徑。

高等植物體在生長過程中通過合成GABA來抵御鹽堿脅迫、缺氧、機(jī)械刺激等逆境環(huán)境。比如鹽脅迫下植物體GAD 活性提高，GABA含量顯著增加以適應(yīng)脅迫。缺氧和機(jī)械刺激導(dǎo)致植物體胞內(nèi)H+積累，胞內(nèi)pH降低，激活GAD促進(jìn)植物體GABA的合成；同時(shí)該GABA合成過程消耗了增加的質(zhì)子，因此能夠發(fā)揮穩(wěn)定植物細(xì)胞內(nèi)pH的作用。由此可見,在植物生長過程中逆境環(huán)境會(huì)脅迫體內(nèi)合成GABA。

圖1 GABA支路及多胺降解生成GABA途徑Fig.1 The pathway of GABA formation by GABA branch and polyamine degradation

1.2 植物種子發(fā)芽脅迫法富集GABA

植物體內(nèi)的GABA本身含量較低，但經(jīng)浸泡發(fā)芽處理后GAD、蛋白酶等內(nèi)源酶被激活，因此GABA得到富集。谷類種子如糙米、小麥、蕎麥等，豆類中大豆、綠豆、蠶豆等都可用于發(fā)芽富集GABA。適宜的溫度、時(shí)間浸泡發(fā)芽處理可以激活種子中的蛋白酶促進(jìn)蛋白質(zhì)分解增加Glu含量，Glu進(jìn)一步由激活的GAD催化生成GABA。SOMBOON等[6]在35 ℃浸泡3 h秈稻糙米再使其發(fā)芽21 h，GABA含量達(dá)(44.89±7.81) mg/100 g，是不發(fā)芽組的15.5倍。WANG等[7]發(fā)現(xiàn),25 ℃浸泡6 h的小麥在發(fā)芽12 h時(shí)GABA增加了50.7%。TRUONG等[8]測得35 ℃浸泡8 h的綠豆發(fā)芽12 h后,GABA含量約為108 mg/100 g，顯著高于原綠豆中GABA含量。XU等[9]在25 ℃浸泡大豆Jindou 25 5 h后,于19、25和32 ℃ 3個(gè)不同溫度下萌發(fā)102 h，測其GAD活力均增加，其中以32 ℃增加2.45倍最為顯著，相應(yīng)的GABA含量增加6.97倍，為(23.82±0.82) mg/100 g。此外，CHEN等[10]發(fā)現(xiàn)浸泡發(fā)芽處理綠豆中GABA的富集還與激活的多胺氧化酶轉(zhuǎn)化多胺生成GABA有關(guān)。利用植物種子發(fā)芽富集GABA方法簡單、綠色安全，可作為富含GABA的植物性食品原料用于功能性食品的加工。

逆境脅迫會(huì)刺激植物體內(nèi)H+和Ca2+增加，從而激活GAD促進(jìn)GABA的積累[5]。如低氧條件下植物電子傳遞鏈?zhǔn)茏?，糖類物質(zhì)經(jīng)糖酵解途徑大量生成丙酮酸，進(jìn)而積累乙醇和乳酸，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化[11]。高鹽濃度逆境條件增加細(xì)胞滲透壓導(dǎo)致植物細(xì)胞膜流動(dòng)性改變，引發(fā)一系列磷酸化反應(yīng)并激活Ca2+通道,導(dǎo)致大量Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中。而發(fā)芽脅迫法將發(fā)芽與脅迫處理相結(jié)合(圖2)，進(jìn)一步促進(jìn)了GAD的表達(dá)，為利用植物種子富集GABA提供了很好的思路(表1)。

圖2 不同脅迫種子發(fā)芽方式Fig.2 Different ways of seed germination under different stress

表1 GABA植物源富集法Table 1 Enrichment of GABA in plant materials

WANG等[7]探究了低氧對發(fā)芽小麥GABA含量的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氧處理后小麥中GABA增加88.73%。OH等[12]在40 ℃厭氧條件下培養(yǎng)8 h浸濕的米糠，GABA含量從10.7 mg/100 g增加到171.5 mg/100 g，進(jìn)一步添加谷氨酸、輔酶后,GABA的積累量達(dá)最大值2 242 mg/100 g。朱云輝等[13]用鹽脅迫發(fā)芽苦蕎來富集GABA，在NaCl濃度為34 mmol/L條件下,苦蕎中GABA富集量達(dá)25.01 mg/100 g，是未發(fā)芽脅迫的2.47倍。此外研究表明，采用2種或2種以上脅迫方式比單一脅迫富集GABA更有效。尹永祺等[14]探究了低溫聯(lián)合低氧脅迫對發(fā)芽玉米籽粒中GABA含量的影響，發(fā)現(xiàn)玉米籽粒經(jīng)低氧脅迫發(fā)芽72 h后，在-18 ℃冷凍6 h和25 ℃回溫4 h條件下，GABA含量達(dá)152 mg/100 g，增加29.9倍。張穎等[15]將通氣脅迫、Ca2+脅迫結(jié)合處理發(fā)芽糙米，在35 mmol/L的Ca2+溶液中浸泡糙米使其發(fā)芽21 h，然后以1.5 L/min的通氣量通氣9 h，最終糙米GABA含量28.18 mg/100 g，比正常發(fā)芽的樣品提高了64.42%。

1.3 新興脅迫技術(shù)促進(jìn)植物源GABA富集

新興的非熱加工技術(shù)(如高靜壓、超聲波、電解水、等離子體)因可激活植物組織中的酶增加GABA含量，同時(shí)具有冷加工可滅活微生物但不會(huì)對熱敏性物質(zhì)產(chǎn)生破壞作用的特點(diǎn)，在植物源GABA富集方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。低于400 MPa的高靜壓可以增強(qiáng)GAD和蛋白酶的活性。如XIA等[16]采用100 MPa高壓條件處理發(fā)芽糙米10 min后，GABA含量從9.30 mg/100 g增加到12.82 mg/100 g。SHIGEAKI等[17]以200 MPa的壓力處理大豆，貯存3 d時(shí)測其GABA量是未經(jīng)高壓處理組的1.35倍。UENO等[18]發(fā)現(xiàn),浸泡15 h的大豆在200 MPa處理10 min時(shí)GABA生成速率為21 μmol/(g·min)，而在300 MPa處理相同時(shí)間時(shí)為74 μmol/(g·min)，表明在300 MPa處理10 min的壓力-時(shí)間組合下GABA產(chǎn)量更高。超聲波可以通過降解發(fā)芽糙米細(xì)胞壁周圍物質(zhì)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+和H+濃度有效激活GAD[19]。張祎等[20]利用超聲波處理發(fā)芽糙米富集GABA時(shí)發(fā)現(xiàn)，樣品以30 kHz頻率處理15 min時(shí)GABA積累量達(dá)到最大，而增加頻率GABA含量下降，表明在相同時(shí)間處理情況下低頻超聲波處理對GABA的積累優(yōu)于高頻。DING等[21]以25 kHz的頻率超聲波處理30 min發(fā)芽小麥GABA含量增加了30.69%。電解水作為一種脅迫處理不僅可以提高GAD的活性，在促進(jìn)谷物發(fā)芽方面還可以發(fā)揮抑菌防霉作用，且制備方便成本低廉，因此在富集GABA方面受到關(guān)注。HAO等[22]發(fā)現(xiàn)微酸性電解水(有效氯含量20.3 mg/L)可使得發(fā)芽蕎麥中GABA的積累達(dá)到143.20 mg/100 g。LIU等[23]也發(fā)現(xiàn)中等有效氯質(zhì)量濃度為17.76 mg/L的強(qiáng)酸性電解水可使發(fā)芽糙米GABA富集量達(dá)到最大值24.36 mg/100 g。低壓等離子體技術(shù)也可以激活糙米中GAD活性，將糙米置于3 kV的低壓等離子體中處理10 min后發(fā)芽24 h，GABA由初始的7.5 mg/100 g顯著增加到28 mg/100 g[24]。可見，新興技術(shù)在富集GABA方面也得到廣泛應(yīng)用。

2 微生物源GABA合成機(jī)制及生產(chǎn)工藝

微生物合成法包括發(fā)酵法和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，前者指微生物直接發(fā)酵基質(zhì)中的L-谷氨酸/鈉鹽生成GABA，發(fā)酵液為成分復(fù)雜的多相體系，GABA分離提純難度較大。后者是指先發(fā)酵培養(yǎng)出含GAD的微生物，再分離出細(xì)胞作為催化劑催化L-谷氨酸/鈉鹽生產(chǎn)GABA，轉(zhuǎn)化液成分簡單，GABA提純簡便、得率高。

2.1 生產(chǎn)GABA的微生物源及合成機(jī)制

生產(chǎn)GABA的菌株來源廣泛且種類多樣(表2)，其合成機(jī)制主要是通過微生物體內(nèi)GAD催化L-谷氨酸脫羧形成GABA。而對于耐酸性細(xì)菌，其GABA合成還依靠于一種特有的GAD抗酸系統(tǒng)，該系統(tǒng)中存在負(fù)責(zé)Glu和GABA轉(zhuǎn)運(yùn)的Glu-GABA(Glu-GABA antiproter)蛋白，當(dāng)細(xì)胞處于酸性環(huán)境中時(shí)，該蛋白可將Glu轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)消耗H+合成GABA[30]，由于H+的消耗形成了質(zhì)子電化學(xué)梯度，膜上質(zhì)子泵F0F1-ATPase將胞外H+轉(zhuǎn)至胞內(nèi)并生成ATP為細(xì)胞生長提供能量。即耐酸性細(xì)菌在維持胞內(nèi)外pH平衡過程中也會(huì)生成GABA。

2.2 發(fā)酵法生產(chǎn)GABA

2.2.1 乳酸菌發(fā)酵法

發(fā)酵法中以公認(rèn)安全且具有多種益生功能的乳酸菌研究最多，其GABA的合成依賴于不同菌種、菌株及培養(yǎng)條件的差異，對于產(chǎn)GABA的菌株通過優(yōu)化其培養(yǎng)條件可以提高GABA產(chǎn)量。RIBEIRO等[31]從奶酪中分離出植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、腸系膜明串珠菌、乳酸乳球菌等多種產(chǎn)GABA的乳酸菌，在添加30 mg/L谷氨酸鈉的MRS肉湯中30 ℃培養(yǎng)48 h后，植物乳桿菌產(chǎn)GABA量最多(937 mg/L)，分別是其他菌株的1.6、19.1和15.1倍。RAFFAELLA等[32]利用植物乳桿菌DSM 19463于添加20 mmol/L 谷氨酸鈉、1%葡萄汁(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的MRS肉湯中30 ℃發(fā)酵72 h，GABA生成量為498.1 mg/L。LIM等[33]從泡菜中篩選出1株短乳桿菌 HYE1，在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%谷氨酸的MRS培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)48 h后得到1 509.68 mg/L GABA，在2.14%麥芽糖、4.01%胰蛋白酶、2.38%谷氨酸(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))、初始pH為4.74優(yōu)化條件下同等溫度、時(shí)間培養(yǎng)后GABA增加28%。此外，混合乳酸菌發(fā)酵也能顯著增加GABA的產(chǎn)量。KIM等[34]在含有3%L-谷氨酸、10%冷凍天麻粉(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)基中添加0.5%的短乳桿菌GABA 100與雙歧桿菌BGN4菌液，30 ℃條件下聯(lián)合發(fā)酵6 d后GABA產(chǎn)量為1.26×104mg/L，顯著高于短乳桿菌GABA 100單獨(dú)發(fā)酵時(shí)的產(chǎn)量。HAN等[35]選用1株產(chǎn)GABA的嗜熱鏈球菌與鼠李糖乳桿菌1∶1(接種量皆為106CFU/mL)共接種于含有15 g/L谷氨酸鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%脫脂乳粉的培養(yǎng)基中37 ℃發(fā)酵48 h后時(shí)產(chǎn)生的GABA質(zhì)量濃度達(dá)8 300 mg/L，是其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)(2 800 mg/L)的2.96倍?？傊?，產(chǎn)GABA的乳酸菌以乳桿菌的報(bào)道最多，通過優(yōu)化其工藝條件或與混合菌株共培養(yǎng)可有效提高發(fā)酵效率，但大部分菌種發(fā)酵產(chǎn)量較低，因此篩選高產(chǎn)GABA的協(xié)同發(fā)酵菌株或開發(fā)高效GABA發(fā)酵工藝尤為重要。

2.2.2 酵母菌發(fā)酵法

近來發(fā)現(xiàn)酵母菌具有大量氨基酸和較高的GAD酶活性，且安全性高，也被用來發(fā)酵生產(chǎn)GABA。但酵母菌GABA合成效率低于乳酸菌，工業(yè)上較少單獨(dú)使用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA，而是通常將其與乳酸菌聯(lián)用來增加GABA產(chǎn)量。如范媛媛等[36]在添加60 g/L 的L-谷氨酸鈉、50 g/L葡萄糖發(fā)芽糙米培養(yǎng)基中接種體積分?jǐn)?shù)4%的復(fù)合菌(短乳桿菌L2∶卡斯酒香酵母ZSM-001體積比為2∶1)，于30 ℃培養(yǎng)90 h后將發(fā)酵液純化濃縮，測得GABA含量達(dá)3.33×104mg/L，比單用卡斯酒香酵母ZSM-001菌發(fā)酵提高了50.8%。ZHANG等[37]用植物乳桿菌BC114和釀酒酵母菌 SC125共接種于100 mL含有5 g/LL-谷氨酸的滅菌桑葚培養(yǎng)基中，在30 ℃孵育72 h后得到2 420 mg/L的GABA，是單獨(dú)用酵母菌培養(yǎng)時(shí)的2.35倍?？梢姡瑢a(chǎn)GABA的酵母菌與乳酸菌協(xié)同發(fā)酵可提高GABA產(chǎn)率，且酵母菌安全性高，是復(fù)合菌種發(fā)酵法制備GABA的理想選擇菌株。

2.2.3 霉菌發(fā)酵法

霉菌作為發(fā)酵工業(yè)中的重要菌也可用于發(fā)酵制備GABA，但霉菌發(fā)酵時(shí)間長、效率低，單獨(dú)用霉菌發(fā)酵制備GABA不僅耗時(shí)且產(chǎn)量低，而將其與乳酸菌共培養(yǎng)或通過優(yōu)化發(fā)酵條件可以提高GABA產(chǎn)量。如邊鑫等[38]對8株霉菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期后進(jìn)行接種發(fā)酵篩選高產(chǎn)GABA的霉菌菌株，觀察到發(fā)酵36 h時(shí)黑曲霉B的GABA產(chǎn)量首先到達(dá)最大，為346 mg/L，而米曲霉3.800發(fā)酵到48 h左右時(shí)才達(dá)到最大GABA值，也僅為674 mg/L。劉志強(qiáng)等[39]將紅曲霉SM048和植物乳桿菌Lac.1共同接種于TYG培養(yǎng)基中，在 pH 4～4.5、30 ℃的條件下進(jìn)行分段發(fā)酵，GABA 產(chǎn)量為520 mg/L，比紅曲霉SM048單獨(dú)發(fā)酵時(shí)提高了147.62%。張慶慶等[40]將紅曲霉接種在添加61.4%干豆渣、38.6%大米粉、0.45%谷氨酸鈉、0.20%(NH4)2SO4、0.23% MgSO4、0.37% KH2PO4、0.25% CaCl2(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))優(yōu)化的固態(tài)培養(yǎng)基中，并在優(yōu)化的32 ℃下培養(yǎng)12 h，GABA產(chǎn)量為41.7 mg/100 g，比優(yōu)化前提高13.4%。霉菌發(fā)酵速度慢、產(chǎn)量低，雖然對其進(jìn)行工藝優(yōu)化后產(chǎn)GABA量有所提升但產(chǎn)量仍較低，效率不及乳酸菌和酵母菌。

2.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法富集GABA

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是利用菌體細(xì)胞作為酶源，先培養(yǎng)細(xì)胞生長到一定的濃度，之后將收集、洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞加入底物反應(yīng)體系中，再經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的GAD作用催化底物脫羧生成GABA。具有周期短、生產(chǎn)成本低、工業(yè)化生產(chǎn)潛力高等優(yōu)點(diǎn)。常用的微生物類型包括野生菌株和基因工程菌株。

2.3.1 野生菌株轉(zhuǎn)化法

野生菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的反應(yīng)條件溫和、所產(chǎn)GABA易于分離純化，具有較好地工業(yè)化應(yīng)用前景。目前野生菌株轉(zhuǎn)化法所用微生物以乳酸菌研究報(bào)道居多。張術(shù)聰?shù)萚41]制備了植物乳桿菌GB01-21的轉(zhuǎn)化液，測得GABA的含量為139.2 g/L，轉(zhuǎn)化率為99.3%。孫麗慧等[42]以短乳桿菌DLF-19076全細(xì)胞作為催化劑，通過3次補(bǔ)料后以87.84%的轉(zhuǎn)化率獲得85.71 g/L的GABA。除乳酸菌外，也有霉菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的研究。田東亮[43]篩選出1株橫梗霉，在最優(yōu)條件下轉(zhuǎn)化12 h后GABA產(chǎn)量達(dá)到3.79 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到36.8%。王志超[44]以霉菌MQ-9為出發(fā)菌株，先對其進(jìn)行紫外-LiCl復(fù)合誘變處理，之后優(yōu)化條件并固定菌體，最終GABA轉(zhuǎn)化率達(dá)到 33.98%。雖然研究表明優(yōu)化條件后利用霉菌產(chǎn)GABA的轉(zhuǎn)化率有所提高，但與多數(shù)乳酸菌生產(chǎn)GABA的轉(zhuǎn)化率(90%以上)相比，霉菌的轉(zhuǎn)化率仍相對較低，因此利用霉菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的研究少于乳酸菌。

2.3.2 基因工程菌株轉(zhuǎn)化法

基因工程菌株因具備表達(dá)水平高、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢，在GABA全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面具有較高的工業(yè)化生產(chǎn)潛力，已報(bào)道的利用基因工程技術(shù)改造細(xì)胞作為催化劑富集GABA的菌株種類多樣，有乳酸菌、大腸桿菌、芽孢桿菌等，其中研究較多的是乳酸菌和大腸桿菌。乳酸菌產(chǎn)GABA得率高、安全度高，是轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA的理想菌種。大腸桿菌具有目標(biāo)基因表達(dá)水平高、易于培養(yǎng)、成本低、GAD活性普遍很高等優(yōu)點(diǎn)，因此常以大腸桿菌作為重組微生物的宿主菌，異源表達(dá)產(chǎn)GABA乳酸菌的GAD構(gòu)建基因工程菌作為生產(chǎn)GABA的細(xì)胞催化劑。KE等[45]以大腸桿菌BW25113為宿主菌，異源表達(dá)乳酸乳球菌的GABD基因，之后以構(gòu)建的基因工程菌作為全細(xì)胞生物催化劑在轉(zhuǎn)化12 h時(shí)GABA產(chǎn)量為308.96 g/L，轉(zhuǎn)化率為99.9%。田靈芝等[46]從1株具有較高GAD活力的植物乳桿菌擴(kuò)增獲得 GAD基因lpgad，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-lpgad，并在大腸桿菌BL21(DE3)中高效誘導(dǎo)其表達(dá)，然后將培養(yǎng)至14 h的菌體離心收集、洗滌，以6.2 g/L的菌濃轉(zhuǎn)化L-谷氨酸底物24 h后GABA產(chǎn)量可達(dá)143.5 g/L，轉(zhuǎn)化率為 97.32%，是原始菌株的2.19倍。此外，芽孢桿菌也可經(jīng)基因工程改造全細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備GABA。如張六六等[47]通過在枯草芽孢桿菌中優(yōu)化GAD及輔因子磷酸吡哆醛再生基因的串聯(lián)表達(dá)，構(gòu)建了1株高產(chǎn)L-谷氨酸脫羧酶的重組枯草芽孢桿菌，通過全細(xì)胞催化底物L(fēng)-谷氨酸24 h，GABA產(chǎn)量可達(dá)327 g/L。與發(fā)酵周期長、后處理過程繁瑣的傳統(tǒng)發(fā)酵法相比，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)GABA周期短、收率高，且利用基因工程技術(shù)異源表達(dá)重組GAD進(jìn)行定向改造能夠進(jìn)一步提高全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)GABA的效率。

表2 產(chǎn)GABA的菌株及GABA產(chǎn)量Table 2 GABA-producing strains and their GABA production

3 GABA功能性食品開發(fā)現(xiàn)狀

大健康背景下人們對生活質(zhì)量的追求提高，功能性食品的開發(fā)能夠滿足人們對傳統(tǒng)食品提出的深層次要求，GABA作為一種功能性因子，在功能性食品生產(chǎn)中的應(yīng)用越來越廣泛。

3.1 GABA糧食制品的開發(fā)

糧食食品是人類生存與發(fā)展的基本條件，采用浸泡、發(fā)芽等方法加工糧食作物可以開發(fā)出多種富含GABA的糧食制品，使得人們能夠在日常的膳食飲食中攝入所需的GABA。米類中以發(fā)芽糙米為研究熱點(diǎn)，在日本已經(jīng)獲得了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，其GABA含量比普通白米高7倍。以發(fā)芽糙米為原料進(jìn)行再加工可以制得豐富的GABA糙米食品。最為簡單的是GABA營養(yǎng)粉，如孫雨茜等[53]擠壓膨化發(fā)芽糙米，進(jìn)行超微粉碎后添加玉米粉、麥芽糊精等輔料得到GABA含量16.63 mg/100 g的風(fēng)味營養(yǎng)粉，高于未發(fā)芽的營養(yǎng)粉產(chǎn)品近 3 倍。發(fā)芽糙米也被用于烘焙、飲料和酒類食品的加工，生產(chǎn)富含GABA的糙米面包、餅干、糙米乳酸菌飲料、糙米白酒等[54]。麥類胚芽中含有較高的Glu含量，是用于生產(chǎn)GABA食品的優(yōu)良原料。以發(fā)芽小麥為原料可以制備出GABA飲料、麥茶，進(jìn)行磨粉后用于生產(chǎn)富含GABA的饅頭、面包等主食。柴美清等[55]以46 ℃水浴保溫孵育1.5 h的麥胚為原料制備了一種GABA含量為82 mg/100 mL的麥胚飲料，是普通麥胚飲料GABA含量的4.56倍。尹永祺等[56]對發(fā)芽后的小麥進(jìn)行炒制焙香，制得一種麥芽茶，其GABA含量為20 mg/100 g。王沛等[57]以小麥為原料先制得富含GABA的芽麥全粉，再添加酵母、水等輔料生產(chǎn)富含GABA的全芽麥饅頭，含量在200～280 mg/100 g，是一種新型功能性全麥?zhǔn)称?。對豆類進(jìn)行發(fā)芽發(fā)酵不僅可以提高GABA含量，還可以改善其營養(yǎng)組分、降低抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而提高其利用價(jià)值。其中最簡單的形式是豆芽食品，以豆類原料直接脅迫發(fā)芽制得。另外較為常見是豆乳食品，如吳嘉琪等[58]以富含GABA的發(fā)芽大豆為主要原料，制作了一種GABA含量為18.56 mg/100 mL的谷芽豆乳。此外還有富含GABA的豆奶、豆醬、豆豉等豆類制品[59]。糧食作物種類豐富且發(fā)芽生長快、周期短，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，目前以開發(fā)出的富含GABA的糧食制品形式最為多樣。隨著食品加工技術(shù)的快速發(fā)展，GABA食品種類會(huì)更加多元化。

3.2 GABA乳制品的開發(fā)

乳酸菌發(fā)酵制得的乳制品由于口感好而廣受消費(fèi)者青睞，因此以發(fā)酵乳制品為載體開發(fā)GABA功能性食品具有較好的市場前景，同時(shí)也符合國家乳業(yè)振興促進(jìn)乳制品創(chuàng)新升級的國家政策。GABA乳制品通常是以高產(chǎn)GABA的乳酸菌為發(fā)酵劑生產(chǎn)富含GABA的奶酪、酸奶、發(fā)酵乳。此外在發(fā)酵過程中添加一定量的谷氨酸鹽或輔酶磷酸吡哆醛進(jìn)行優(yōu)化可以提高產(chǎn)品中GABA產(chǎn)量。CARAFA等[60]利用產(chǎn)GABA嗜熱鏈球菌84C(106CFU/mL)和短乳桿菌DSM 32386(10 CFU/mL)混合發(fā)酵制備奶酪，在成熟20 d時(shí)得到GABA含量(9.1±2.2) mg/100 g 的奶酪，高于嗜熱鏈球菌84C單獨(dú)發(fā)酵時(shí)(7.1±2.1) mg/100 g，為利用共培養(yǎng)物開發(fā)功能性奶酪提供了思路。EL-FATTAH等[61]利用濃縮乳清蛋白強(qiáng)化的脫脂乳粉發(fā)酵酸奶，在發(fā)酵劑中添加能賦予酸奶高粘特性和產(chǎn)GABA混合菌后發(fā)現(xiàn)，酸奶中GABA含量達(dá)1.64 mg/100 mL，是相應(yīng)只添加具有高粘性菌株處理組的4.56倍。韓嘯[62]以1株產(chǎn)GABA的短乳桿菌DL1-11制備了一種功能性發(fā)酵乳，在添加0.15%的L-谷氨酸鈉進(jìn)行優(yōu)化后產(chǎn)品中GABA含量達(dá)(101.20±2.48) mg/100 g，是優(yōu)化前的2.37倍?？傊ㄟ^高產(chǎn)GABA乳酸菌的篩選及乳品配料的改良，如添加谷氨酸鈉等物質(zhì)，能夠顯著提高乳制品中GABA產(chǎn)量，但由于谷氨酸鈉在乳制品中應(yīng)用較少，因此篩選或培育高產(chǎn)GABA的乳酸菌可行性更好。

3.3 GABA肉制品的開發(fā)

GABA肉制品的開發(fā)研究與糧食制品和乳制品相比較少，主要報(bào)道的是用乳酸菌添加于發(fā)酵劑中制備富含GABA的肉制品。在乳酸菌發(fā)酵4個(gè)月和12個(gè)月的日本發(fā)酵魚制品aji-no-susu中分別檢測到150和140 mg/100 g的GABA，并從中分離出2株產(chǎn)GABA的蛋白酶乳桿菌KN1和KN2，表明產(chǎn)GABA的乳酸菌可用于發(fā)酵生產(chǎn)含GABA的肉制品[63]。KANTACHOTE等[64]將高產(chǎn)GABA的菌株用于發(fā)酵香腸的制作，以產(chǎn)GABA的戊糖片球菌HN8和那慕爾乳桿菌NH2為混合發(fā)酵劑(接種量各為6 lg CFU/g)發(fā)酵豬肉香腸，得到的產(chǎn)品中GABA含量達(dá)396.2 mg/100 g。RATANABUREE等[65]使用同樣的2株菌用于一種泰式“Nham”香腸的制作，在發(fā)酵劑中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%谷氨酸鈉后其GABA含量為405.1 mg/100 g，大約高出市面上普通“Nham”香腸的8倍。目前GABA肉制品的開發(fā)報(bào)道較少，通常能在發(fā)酵肉中存活的細(xì)菌需要很強(qiáng)的耐受力，因此需要篩選高產(chǎn)GABA且高耐受力的乳酸菌以更好地應(yīng)用于GABA肉制品的開發(fā)。

4 展望

GABA作為一種對人體有多種生理功能的生物活性物質(zhì)，已受到國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。近來蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展及不斷提高的生活健康水平為GABA的研究提供了更為廣闊的研究空間，未來GABA資源的開發(fā)方向之一是可以通過深入了解GAD的催化機(jī)制，利用組學(xué)等知識對該酶進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改良以獲得高轉(zhuǎn)化效率的GAD，從而提高GABA合成量。另一開發(fā)方向是有針對性地開發(fā)適合不同人群的富含GABA的食品，如開發(fā)適合中老年人群的GABA主食類產(chǎn)品(饅頭、面包、發(fā)芽糙米等)、開發(fā)適合中青年人群的便攜式休閑化GABA食品(餅干、發(fā)酵奶片等)以及適合大眾人群的GABA酸奶等乳酸菌發(fā)酵食品，以期通過在日常生活中攝入這些富含GABA的食品來改善現(xiàn)代人因生活節(jié)奏快、壓力大等因素導(dǎo)致的焦慮、失眠等亞健康狀況。