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    GLP-1類似物的設(shè)計及口服制劑研究

    2020-12-22 02:25:10張云霄
    關(guān)鍵詞:糜蛋白酶類似物利拉魯

    張云霄,王 清,劉 宇

    (湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽 414006)

    糖尿病是一種由多種原因引起的血糖失控高出正常水平所造成的全身性代謝性疾病,隨著病程發(fā)展,會導(dǎo)致多種嚴重的并發(fā)癥,可分為I 型和II 型糖尿病.胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)主要應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的治療,它是由空腸L 細胞分泌的功能性短肽與胰島β 細胞受體相結(jié)合,以葡萄糖依賴性的方式促進胰島素分泌,抑制胰高血糖素分泌,改善血糖水平,在治療中實現(xiàn)患者體重減輕,并且對心臟和內(nèi)皮起到保護作用[1~3].然而,GLP-1 在人體內(nèi)半衰期短,易被降解,不能作為藥物直接使用.目前針對GLP-1 結(jié)構(gòu)進行的改造,已成功獲得多個臨床應(yīng)用的長效GLP-1 類似物.但長效GLP-1 類似物往往采用注射方式給藥,患者接受度較差,因此開發(fā)口服長效GLP-1 類似物不僅十分重要和必要,而且具有廣闊的市場應(yīng)用前景.

    多肽或蛋白質(zhì)類藥物若采用口服給藥的方式,絕大多數(shù)會被胃腸道系統(tǒng)酶類水解,從而喪失其生理活性[4].另外,多肽類藥物由于脂溶性差,很難實現(xiàn)腸道吸收.一般而言,可以從以下兩個方面提高多肽類藥物的吸收利用度:(1)改變序列中胃腸道系統(tǒng)蛋白水解酶識別的氨基酸酶切位點,通??梢越档投嚯念愃幬锉凰獾娘L險;(2)采用非共價修飾傳輸介質(zhì)介導(dǎo)技術(shù),例如Emisphere 公司研究開發(fā)的SNAC 傳輸介質(zhì)介導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用到索馬魯肽、胰島素、甲狀腺降鈣素等多種多肽類藥物的口服制劑,效果良好[5].石膽酸,又稱膽石酸,存在于高等脊椎動物膽汁中,其分子結(jié)構(gòu)中既含有親水基團,又含有疏水基團,故同時具有親水性和疏水性,表現(xiàn)出很強的界面活性.本文通過對已經(jīng)臨床應(yīng)用的利拉魯肽序列進行胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶酶切位點分析,采用多肽Fmoc 固相合成法制備GLP-1 類似物,通過HPLC 分離純化與質(zhì)譜進行鑒定.然后,以上述商業(yè)化輔助滲透劑SNAC 為參照,評價設(shè)計的GLP-1 類似物經(jīng)石膽酸孵育處理后,分別在胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶三種蛋白酶存在條件下抵抗降解的能力.

    1 實驗部分

    1.1 試劑

    乙腈;DIEA(N,N-二異丙基乙胺);甲醇;乙醚;DMF(二甲基甲酰胺);TFA(三氟乙酸);苯甲醚;苯甲硫醚;EDT(1,2-巰基乙烷);DCM(二氯甲烷);MBHA 樹脂;HATU;HoBt;Fmoc-AA-OH;Pal-Glu(OSu)-OtBu;Fmoc-Lys(Dde)-OH;茚三酮;SNAC;碳酸氫銨;胃蛋白酶;糜蛋白酶;胰蛋白酶.

    1.2 主要儀器和設(shè)備

    小型低溫高速離心機;臺式高速大容量冷凍離心機;液相色譜儀;低溫冷凍干燥機;生物搖床;電子分析天平;循環(huán)水式多用真空泵;超低溫保存箱;層析管;色譜柱;pH 計.

    1.3 實驗方法

    1.3.1 GLP-1 類似物的設(shè)計

    前期已有研究[5,6]報道了維持GLP-1 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵氨基酸殘基,丙氨酸掃描實驗表明His7,Gly10,Phe12,Thr13,Asp15,Tyr19,Gly22,Phe28,Ile29,Trp31 和Leu32 是維持其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生理功能執(zhí)行的關(guān)鍵殘基,本文以此為基礎(chǔ)對GLP-1 進行設(shè)計.

    利用生物信息學(xué)技術(shù)對GLP-1 進行蛋白酶酶切位點預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)GLP-1 序列中存在7 個胃蛋白酶酶切位點,分別位于其序列的第11、12、19、20、27、31 和32 位氨基酸殘基;存在3 個胰蛋白酶酶切位點,分別位于其序列的第26、34 和36 位氨基酸殘基;存在4 個糜蛋白酶酶切位點,分別位于第 12、19、28 和31 位氨基酸殘基.由此確定了在GLP-1 序列的C 端可以突變的氨基酸有Glu27、Ala30、Val33、Lys34以及Gly35.

    本文設(shè)計策略為:將Ala8 突變成氨基異丁酸(aminoisobutyric acid,Aib),命名為類似物1;將Ala8 突變成Aib,并將第30、34 位氨基酸殘基突變成谷氨酸,命名為類似物2;將第Ala8 突變成Aib,并將第30、33、34、35 位氨基酸殘基突變成谷氨酸,命名為類似物3.GLP-1 類似物序列設(shè)計如圖1所示.

    圖1 GLP-1 類似物序列設(shè)計

    1.3.2 GLP-1 類似物的合成

    采用Fmoc 固相合成制備GLP-1 類似物,進行MBHA(0.1 mmol/0.31 mmol/g)樹脂的膨化與去保護,稱取相應(yīng)氨基酸、HATU 和HoBt 進行氨基酸活化,偶聯(lián)反應(yīng)1~2 h,2%水合肼去掉Dde 基團,用裂解試劑(TFA ∶ EDT∶苯甲醚∶苯甲硫醚=90∶2∶3∶5)進行裂解,加入6 倍量的冰乙醚沉淀,離心,樣品凍干.

    1.3.3 HPLC 純化

    稱取50 mg 樣品用10 mL 溶解液(水∶醋酸∶DMF∶乙腈=4∶2∶2∶2)溶解.流動相A 為含0.1%TFA的超純水,流動相B 為含0.1%TFA 的乙腈,流速為2 mL/min,乙腈梯度變化:0~15 min,40%~70%;15~28 min,70%~90%;28~30 min,90%~40%,質(zhì)譜鑒定收集目的峰,真空冷凍干燥.

    1.3.4 質(zhì)譜鑒定

    將 CCA 粉末溶于 50% 乙腈(含 0.1% TFA)中,配制成過飽和溶液.震蕩混合助溶 CCA,12000 rpm,離心 5 min,取上清備用.先取 0.5 μL 待測樣品至點樣板上,干燥后再取 0.5 μL CCA 溶液均勻覆蓋待測樣品,待自然風干后進行質(zhì)譜測定.

    1.3.5 蛋白酶水解

    分別稱取4 mg 上述凍干的類似物,用10 mL 100 mM 碳酸氫鈉(pH7.5)溶解,每管500 μL.實驗分為陽性對照組、陰性對照組和實驗組,其中不加酶和輔助劑的樣品管作為陽性對照,加酶但不加輔助劑的樣品管作為陰性對照,實驗組則分別加入10 mM石膽酸和100 mM SNAC,同時按照類似物∶酶=100∶1比例分別加入胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶.其中胃蛋白酶為pH1.5 的水溶液,其他操作一致.混合均勻后放置在37 ℃孵育,分別在2、4、6、12 和24 h 取樣[5],取樣后煮沸5~10 min 終止水解反應(yīng).

    1.3.6 石膽酸濃度優(yōu)化

    分別加入2、4、6 和8 mM 石膽酸至類似物1 中,探討加入不同濃度石膽酸抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶水解作用,操作方法同蛋白酶水解實驗.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 GLP-1 類似物合成

    樣品制備利用多肽Fmoc 固相合成法獲得了利拉魯肽和3 個新型GLP-1 類似物,HPLC 分離純化,經(jīng)MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定利拉魯肽、類似物1、類似物2 和類似物3 的分子量分別為3747.9490 Da、3763.9690 Da、3793.3037 Da 和3895.0518 Da,實際分子量與理論分子量一致,這表明通過Fmoc 固相合成法成功地制備了利拉魯肽和3 個新型GLP-1 類似物,色譜及質(zhì)譜結(jié)果如圖2所示.

    圖2 利拉魯肽HPLC 和質(zhì)譜圖

    2.2 蛋白酶水解

    利拉魯肽的陽性對照組在37 ℃保溫24 h 仍然穩(wěn)定存在.糜蛋白酶水解利拉魯肽,在100 mM SNAC存在下,水解2 h,利拉魯肽降解完全;而在10 mM 石膽酸存在下,水解24 h,仍有部分利拉魯肽存在.胰蛋白酶水解利拉魯肽結(jié)果與糜蛋白酶水解結(jié)果相近(數(shù)據(jù)未展示),這些結(jié)果表明,相比于SNAC,石膽酸可以更好地保護利拉魯肽抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解作用(圖3).

    圖3 糜蛋白酶水解利拉魯肽的質(zhì)譜結(jié)果

    類似物1 在100 mM SNAC 存在下,經(jīng)糜蛋白酶水解2 h 后幾乎降解完全,而在10 mM 石膽酸存在下,經(jīng)糜蛋白酶水解24 h 還有大部分存在.這些結(jié)果表明,相比于SNAC,石膽酸可以更好地保護類似物1 抵抗糜蛋白酶的水解作用(圖4).

    圖4 糜蛋白酶水解類似物1 的質(zhì)譜結(jié)果

    類似物1 在100 mM SNAC 存在下,經(jīng)胰蛋白酶水解2 h 僅有少部分存在,而在10 mM 石膽酸存在下,經(jīng)胰蛋白酶水解24 h 還有大部分存在.這些結(jié)果表明,相比于SNAC,石膽酸可以更好地保護類似物1 抵抗胰蛋白酶的水解作用(圖5).

    圖5 胰蛋白酶水解類似物1 的質(zhì)譜結(jié)果

    類似物2 在100 mM SNAC 中經(jīng)糜蛋白酶水解2 h 降解完全,而在10 mM 石膽酸中經(jīng)糜蛋白酶水解6 h 還有部分存在,12 h 后才降解完全.這些結(jié)果表明,相比于SNAC,石膽酸可以更好地保護類似物2 抵抗糜蛋白酶的水解作用(圖6).類似物2 在100 mM SNAC 中經(jīng)胰蛋白酶水解2 h 降解完全,而在10 mM 石膽酸中經(jīng)胰蛋白酶水解2 h 只有少部分存在,表明石膽酸抵抗胰蛋白酶水解類似物2 的作用相比SNAC 只有微弱的優(yōu)勢.

    圖6 糜蛋白酶水解類似物2 的質(zhì)譜結(jié)果

    類似物3 在100 mM SNAC 中經(jīng)胰蛋白酶水解2 h 僅剩少部分,而在10 mM 石膽酸中經(jīng)胰蛋白酶水解24 h 仍有部分存在.這些結(jié)果表明,相比于SNAC,石膽酸可以更好地保護類似物3 抵抗胰蛋白酶的水解作用(圖7).類似物3 在100 mM SNAC 存在下經(jīng)糜蛋白酶水解2 h 降解完全,而在10 mM 石膽酸中經(jīng)糜蛋白酶水解6 h 還有少部分存在,12 h 后才降解完全.這些結(jié)果表明,相比于SNAC,石膽酸可以更好地保護類似物3 抵抗糜蛋白酶的水解作用.

    圖7 胰蛋白酶水解類似物3 的質(zhì)譜結(jié)果

    利拉魯肽、類似物1、類似物2 和類似物3 分別加10 mM 石膽酸和100 mM SNAC,在胃蛋白酶下均降解完全,表明石膽酸和SNAC 均不能抵抗胃蛋白酶水解利拉魯肽的作用.

    2.3 石膽酸濃度優(yōu)化

    類似物1在石膽酸存在下表現(xiàn)出最優(yōu)的抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶水解作用,因此選用類似物1探索石膽酸的最佳濃度.類似物1 中加入2 mM 石膽酸時,經(jīng)糜蛋白酶水解2 h 完全降解,而加入的石膽酸濃度為4、6、8 mM 時,水解24 h 仍穩(wěn)定存在(圖8).而經(jīng)同樣處理,類似物1 中加入的石膽酸濃度為2、4、6、8 mM 時,在胰蛋白酶中水解24 h 后仍穩(wěn)定存在.因此,石膽酸最佳濃度為4 mM.

    圖8 糜蛋白酶水解經(jīng)不同濃度石膽酸處理的類似物1 質(zhì)譜結(jié)果

    3 結(jié)論

    本文設(shè)計了3 個新型GLP-1 類似物,并探討了石膽酸作為滲透輔助劑抵抗胃腸道酶類水解的效果.結(jié)果表明,相比于SNAC,石膽酸在抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶水解作用時表現(xiàn)出更優(yōu)異的效果;10 m 石膽酸抵抗糜蛋白酶和胰蛋白酶水解作用效果最優(yōu)的是類似物1,其次分別是利拉魯肽和類似物3,類似物2 效果最差;石膽酸的最佳作用濃度為4 mM.石膽酸雖不能抵抗胃蛋白酶的水解作用,但有望制成腸溶制劑實現(xiàn)多肽類藥物的口服給藥.

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