獸用生物制品活菌計數(shù)方法改進的研究

張一幟，張 媛，李 建，王秀麗，劉元杰，王 楠，徐 磊，辛凌翔，任小俠，劉 博，魏 津，馬 欣，彭小兵，李旭妮，彭國瑞，李俊平， 羅玉峰

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

活菌計數(shù)是細菌類活疫苗質量標準中重要的檢驗參數(shù)，與疫苗的保護效果關系緊密［1］。 現(xiàn)行獸用細菌類生物制品檢驗中的活菌計數(shù)方法依照《中國獸藥典》（2015 年版三部）附錄3405“活菌計數(shù)法”執(zhí)行［2］，但其中有部分內容過于籠統(tǒng)，試驗成立條件缺乏科學標準，以至于全國各疫苗生產企業(yè)檢驗人員對方法的要求有理解上的差別，造成企業(yè)間乃至同企業(yè)人員間檢驗結果經常出現(xiàn)差異，最終影響細菌活疫苗質量的評判。 因此，本研究擬參照國內外活菌計數(shù)相關規(guī)程，通過試驗比對研究，對“活菌計數(shù)法”進行修訂，使該方法要求更明確，普適性更高，從而減少操作誤差，提升“活菌計數(shù)法”的規(guī)范性、可操作性及檢驗結果可靠性。

目前美國農業(yè)部獸醫(yī)生物制品檢驗所依照的美國聯(lián)邦法規(guī)第九卷（9 CFR）中，對于活菌計數(shù)方法有著明確要求［3］，并于2015 年完善修訂了標準操作規(guī)程（BBSOP0019．04）［4］。 相對于我國所用的活菌計數(shù)方法，主要有兩點不同：①在將稀釋液滴加于平板這一操作中，所使用的儀器量程不同，我國采用1 mL 量程的吸管滴加0．1 mL 菌液，而美國采用100 ～200 μL 量程的移液器滴加0．1 mL 菌液；②在滴加菌液后，我們目前所用方法是靠傾斜和轉動將菌液分散，而美國使用無菌涂布器將菌液涂布開。 本研究針對當前活菌計數(shù)法三個方面關鍵點，參考美國農業(yè)部獸藥生物制品中心公開的SOP（BBSOP0019．04）和多位檢驗員的操作建議，對于平板干濕程度、滴加平板儀器、菌液分散方法進行單變量比對試驗，提出操作更方便、更精準、容錯率更高的“活菌計數(shù)法”的修訂方案，并進一步提出以標準差（s）衡量結果的有效性及提供參考值。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 待檢樣品、吸管（1 mL、5 mL、10 mL）、試管（18 mm ×18 cm）、15 mL 離心管、50 mL離心管、培養(yǎng)皿（直徑9 cm）、無菌涂布器、200 μL移液器和配套吸頭；待檢樣品所需稀釋液及固體培養(yǎng)基（本實驗所用稀釋液及固體培養(yǎng)基均購自北京中海生物科技有限公司）參照表1。

表1 不同細菌產品活菌計數(shù)用稀釋液及適宜培養(yǎng)基對應表Tab 1 Correspondence table of diluent and suitable medium for different bacterial products plate count

1．2 儀器設備 微波爐、恒溫水浴箱、生物安全柜、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、渦旋振蕩儀、電動移液器、廢棄液體及吸管存放用容器。

1．3 試驗方法

1．3．1 培養(yǎng)平板制備 根據待檢樣品種類選取相應瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至50 ～60 ℃后于生物安全柜中加入相應營養(yǎng)成分（37 ℃預熱）后制備平板，每付培養(yǎng)皿加入瓊脂15 ～20 mL。 待平板凝固后進行預培養(yǎng)或裝入塑封袋4 ℃保存。

1．3．2 稀釋菌液 按待檢產品質量標準所規(guī)定的每頭（羽）份樣品應至少含有的活菌數(shù)或科研實驗要求確定樣品的稀釋倍數(shù)。 先進行放大稀釋，再進行10 倍系列稀釋，稀釋過程中通過使用渦旋振蕩器或上下顛倒混勻保證菌液稀釋液充分混勻，最終稀釋度選擇每付培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)40 ～200 CFU 為宜。

1．3．3 滴平板 用1 mL 吸管或200 μL 移液器分別從最終稀釋管中吸取菌液，滴于3 個平板上，100 μL／平板。 之后轉動平板或用無菌涂布器將菌液涂均勻（3 個平板用同一個涂布器的同一邊進行涂布，涂布時注意不要將菌液涂布到平板邊緣）。之后蓋上平板蓋正置于培養(yǎng)箱中，30 min 后將平板倒置，培養(yǎng)至適宜時間。

1．3．4 計算菌數(shù) 肉眼觀察并計數(shù)平板中的菌落，算出3 個平板的平均菌落數(shù)，再乘以總體稀釋度（包括放大稀釋和連續(xù)稀釋）倍數(shù)，再乘以10（每付平板滴加菌液0．l mL），即為每1．0 mL 原樣品中所含的菌數(shù)，再除以疫苗的頭（羽）份數(shù)，即為每頭（羽）份疫苗中所含有的活菌數(shù)。

1． 3． 5 數(shù) 據統(tǒng)計 使用GraphPad Prism 6． 0（GraphPad， La Jolla， CA， USA） 軟件以及SPSS 16．0軟件對于實驗結果進行統(tǒng)計學分析，其中以平均值±標準平均誤差（） 表示。 數(shù)據分析采用t檢驗法來比較各組間差異。 其中ns （P＞0．05），即no significant，表示無顯著差異，?（P＜0．05）表示有顯著差異，??（P＜0．01） 表示差異十分顯著。

2 結果與分析

2．1 活菌計數(shù)法相關步驟的優(yōu)化

2．1．1 平板干濕程度 《中國獸藥典》（2015 年版三部）附錄3405 收錄的“活菌計數(shù)法”對于平板干濕程度沒有提出明確要求。 檢驗員們的多年操作經驗均認為平板干濕程度對于活菌計數(shù)試驗至關重要。 為確定平板干濕程度，考慮到操作方法的普適性和易操作性，本研究采取將制備平板完成后（平板凝固）進行預培養(yǎng)，以預培養(yǎng)時間量化平板干濕程度。 本次試驗使用仔豬副傷寒沙門氏菌活疫苗參考品進行活菌計數(shù)，馬丁瓊脂平板在制備完成凝固后（倒板后30 min），轉移至培養(yǎng)箱進行預培養(yǎng)0．5 ～48 h 不等（圖1）。 分別取出預培養(yǎng)不同時間的馬丁瓊脂平板進行活菌計數(shù)，將適宜濃度的菌液滴加至平板上，轉動傾斜引導菌液在平板上均勻分散之后放入培養(yǎng)箱中，在不開蓋的情況下正置30 min后倒置培養(yǎng)24 h，觀察各個平板中菌落是否出現(xiàn)堆疊、是否在邊緣生長并記錄計數(shù)結果。

圖1 不同預培養(yǎng)時間平板進行活菌計數(shù)結果（0．5 ～48 h）Fig 1 Bacterial plate count results on plates with different pre－culture time （0．5 ～48 h）

結果顯示平板預培養(yǎng)12 ～24 h 后進行活菌計數(shù)試驗能夠順利計數(shù)，菌落分布無異常情況。 而預培養(yǎng)小于12 h 的平板會因過濕而導致菌落堆疊、菌落貼邊生長，最終無法計數(shù)。 預培養(yǎng)48 h 由于平板過干，菌液無法充分分散，部分菌落出現(xiàn)重疊情況，從而影響計數(shù)結果。 因此平板最好預培養(yǎng)12 ～24 h后再進行活菌計數(shù)試驗。

2．1．2 滴加菌液 將稀釋液滴加于平板這一操作步驟，目前采用1 mL 量程的吸管滴加0．1 mL 菌液的方法，而美國與歐洲使用100 ～200 μL 量程的移液器滴加0．1 mL 菌液。 在正確合規(guī)的操作下，引用誤差越小，準確度越高，而引用誤差是絕對誤差的最大值與儀表量程的比值，即與儀器量程負相關［5］。 從儀器規(guī)格來看，選用量程更符合使用體積的儀器更為精確。

為驗證兩種滴加菌液方法對于活菌計數(shù)試驗的影響，本研究分別使用兩種方法進行多次活菌計數(shù)試驗，所用樣品及其他步驟完全相同，將所得結果進行統(tǒng)計學分析。 結果說明使用移液器滴加菌液方法與傳統(tǒng)方法無顯著性差異，可以互相替代，而且移液器滴加菌液方法的標準差和標準誤均小于傳統(tǒng)方法，說明移液器方法的離散程度更低，隨機誤差更小（表2 和圖2）。

表2 不同儀器滴加菌液活菌計數(shù)結果統(tǒng)計表Tab 2 Bacterial plate count statistics with different instruments

圖2 不同儀器滴加菌液活菌計數(shù)結果Fig 2 Bacterial plate count results with different instruments

2．1．3 菌液分散 將稀釋液滴加于平板這一操作步驟，我國目前采用傾斜和轉動平板將菌液分散，而美國與歐洲使用無菌涂布器將菌液涂布開。 為驗證兩種菌液分散方法對于活菌計數(shù)試驗的影響，本研究分別按照傳統(tǒng)旋轉傾斜法和涂布法進行菌液分散，進行多次活菌計數(shù)試驗，所用樣品及其他步驟完全相同，將所得結果進行統(tǒng)計學分析。 結果顯示使用涂布器分散菌液方法與傳統(tǒng)方法無顯著性差異，可以互相替代，而且涂布器分散菌液方法的標準差和標準誤均小于傳統(tǒng)方法，說明涂布法的離散程度更低，隨機誤差更?。ū? 和圖3）。

表3 不同菌液分布方式活菌計數(shù)結果統(tǒng)計表Tab 3 Bacterial plate count statistics in different distribution methods

圖3 不同菌液分布方式活菌計數(shù)結果Fig 3 Bacterial plate count results in different distribution methods

2．2 修訂方法與傳統(tǒng)方法比對 本研究第一部分通過單變量試驗確定了平板適宜預培養(yǎng)的時間，之后驗證使用移液器滴加菌液和用涂布器分散菌液可以替代原方法，且結果的離散程度小于原方法。在原方法的基礎上，使用移液器滴加菌液和用涂布器分散菌液，在此我們稱之為“修訂方法”。 第二部分我們使用修訂方法與目前的傳統(tǒng)方法進行比對。將同一樣品分別使用傳統(tǒng)方法和修訂方法進行比對試驗，結果顯示兩種方法沒有顯著性差異，可以互相替代，而且修訂方法的標準差和標準誤均小于傳統(tǒng)方法，說明修訂方法的離散程度更低，隨機誤差更小（表4 和圖4）。

圖4 活菌計數(shù)傳統(tǒng)方法與修訂方法比對結果Fig 4 Comparison between traditional method and revised method for bacterial plate count

表4 活菌計數(shù)傳統(tǒng)方法與修訂方法比對結果統(tǒng)計表Tab 4 Comparison between traditional method and revised method for bacterial plate count

2．3 結果平行性條件優(yōu)化 在《中國獸藥典》（2015 年版三部）附錄3405 收錄的“活菌計數(shù)法”中，在重檢要求中對于結果平行性方面做出了規(guī)定：“如果有片狀菌落生長，或同一稀釋度平板間菌落相差50%以上時，應重檢。”其中對于活菌計數(shù)結果平行性的要求表述過于籠統(tǒng)，（最大值－最小值）／N≥50%則該次檢驗不成立，而其中N 并沒有明確指出是什么值，是否是平均值或其他具體某一個樣本數(shù)值，以至于該評判標準在實際應用中會產生標準不一的問題。 “最大值－最小值”在統(tǒng)計學中稱為極差，是用來反映刻畫一組數(shù)據的離散程度和變異范圍，但由于極差只指明了測定值的最大離散范圍而不包括全部測量值的信息，并且極差易受極端值影響，因此不能反映其間樣本的分部情況。此外，從公式（最大值－最小值）／N 值可以看出，數(shù)值大小與N 的關系成反比。 在活菌計數(shù)結果在規(guī)定范圍（40 ～200）內的情況下，N（一般取平均值）越低，（最大值－最小值）／N 值越大，即此種方法對于數(shù)據離散性的衡量會因N 值大小不同產生差異。

本研究提出使用標準差作為衡量活菌計數(shù)結果平行性的指標［6］。 為確定既符合現(xiàn)行平行性要求，又符合活菌計數(shù)結果實際情況的標準差值，我們將本研究中進行活菌計數(shù)的數(shù)據（表5）以及多位檢驗員驗證活菌計數(shù)修訂方法的數(shù)據（均符合當前數(shù)據平行性規(guī)定）（表6、表7）進行整理，計算每組結果（3 個平板為一組）的標準差和傳統(tǒng)方法中提出的“（最大值－最小值）／平均值”。

表5 本研究活菌計數(shù)結果平行性指標分析－1Tab 5 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study－1

表6 本研究活菌計數(shù)結果平行性指標分析－2Tab 6 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study－2

如表5 －表7 所示，各組結果的極差／平均值均在50%以內，符合現(xiàn)行結果平行性要求。 而各組標準差值均小于20，且浮動范圍較為集中于15 ～5 之間，占整個樣本量的74%。 這說明即使在操作符合規(guī)定的情況下，每次檢驗的3 個結果之間還是會出現(xiàn)差距，這是由試驗當中的隨機誤差所引起的，而標準差正是衡量此隨機誤差的一把尺子，應當符合隨機誤差的基本規(guī)律——呈正態(tài)分布。 使用SPSS16．0 軟件對于標準差數(shù)據進行兩種正態(tài)分布檢驗（Shapiro － Wilk 檢驗及Kolmogorov － Smirnov檢驗），結果均為顯著（Sig ＞0． 05 即正態(tài)分布）（圖5 －圖7），這證實了前文中的觀點，說明標準差可以作為衡量活菌計數(shù)結果平行性的標準，并能夠有效地描述隨機誤差。

圖5 標準差數(shù)據正態(tài)分布檢驗結果－1Fig 5 Normal distribution test results of Standard Deviation data－1

圖6 標準差數(shù)據正態(tài)分布檢驗結果－2Fig 6 Normal distribution test results of Standard Deviation data－2

圖7 標準差數(shù)據正態(tài)分布檢驗結果－3 Fig 7 Normal distribution test results of Standard Deviation data－3

表7 本研究活菌計數(shù)結果平行性指標分析－3Tab 7 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study－3

3 討論與結論

國內外目前對活細菌的計數(shù)有許多方法，其中滴板計數(shù)是一種比較常用且簡便的計數(shù)方法。 該方法根據估算對于液體菌液進行2 ～10 倍梯度稀釋，之后將終稀釋液滴加到計數(shù)板上，在顯微鏡下計數(shù)，之后乘以相應的稀釋倍數(shù)，能夠快速即時測得菌液中的活菌數(shù)量［7］。 Seo EY 等利用熒光顯微技術對于大量細菌進行快速計數(shù)［8］。 Bogomolny E等建立了利用固體激光器使用光學方法實時測定活細菌數(shù)量的方法，結果穩(wěn)定、高效、精確［9］。London R 等開發(fā)了自動化生長微生物直接檢測技術，通過微生物熒光標記和激發(fā)熒光，能夠快速自動區(qū)分不同的原核、真核微生物并即時完成計數(shù)［10］。 這些先進方法或需要使用昂貴的儀器試劑，或需要對不同細菌的估算值進行更多的數(shù)據積累。

本研究針對當前活菌計數(shù)法的三個方面關鍵點，參考美國農業(yè)部獸藥生物制品中心公開的SOP（BBSOP0019．04）和多位檢驗員的操作建議，通過單變量比對試驗改進了活菌計數(shù)平板的干濕度要求，使得檢驗用平板干濕程度能夠實現(xiàn)均勻分散且不易流邊，同時排除了之前方法當中的生物安全隱患；確定了滴平板儀器，使用量程更適合、精確度更高、操作更方便的儀器進行菌液的滴加，減少了系統(tǒng)誤差并且使得操作更為簡單；選擇涂布器進行菌液分散，也使得整個方法更易操作，菌落分散均勻且不易流邊。

原方法中對于各平板結果平行性的要求較為模糊，缺少統(tǒng)計學支撐。 本研究提出使用標準差衡量活菌計數(shù)結果的平行性，標準差是離均差平方的算數(shù)平均數(shù)的平方根，即方差的算術平方根，是反映一組數(shù)據離散程度最常用的一種量化形式，是表示精確度的重要指標。 當使用活菌計數(shù)方法進行檢測時，由于檢測方法總是有誤差的，所以檢測值并不是其真實值。 設定一個只取決于檢測值與真實值之間的差距，而與真實值大小無關的穩(wěn)定性指標，才是評價檢測方法最有決定性的指標，從而保證每批檢驗結果的準確可靠［11］。 進一步通過實驗統(tǒng)計數(shù)據證實，活菌計數(shù)實驗中隨機誤差所引起的結果標準差變化，是符合隨機誤差的基本規(guī)律——呈正態(tài)分布的。

本研究以試驗數(shù)據為基礎，比對分析后對于相關規(guī)程制修訂提出了意見，希望能夠對細菌類獸用生物制品相關從業(yè)者在生產研究、制定規(guī)程等方面提供幫助和啟發(fā)。