秦楓 李金貴 朱善元 王紅昀 王安平 吳雙

摘要：為確定ZTCI+IⅡ型天然澄清劑用于三七（Panax notoginsengj莖葉皂苷提取液除雜的最佳工藝，在單因素分析的基礎(chǔ)上，以藥物質(zhì)量濃度、澄清劑用量、作用溫度為自變量，以皂苷含量和固形物去除率作為評價指標(biāo)，建立三因素三水平的Design-Expert響應(yīng)面分析方法。結(jié)果表明，最佳除雜工藝為藥液質(zhì)量濃度（生藥質(zhì)量與皂苷提取液體積之比）為0.19 g/mL，ZTCI+IⅡ型天然澄清劑2組分加入順序為先B組分后A組分，澄清劑B組分和A組分加入量分別為10%、5%藥液體積，作用溫度為40℃。在此工藝條件下進(jìn)行三七莖葉皂苷提取液除雜工藝的優(yōu)化，得出固形物去除率為28.40%，皂苷保留率為92.22%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.74%和0.56%，重現(xiàn)性較好，驗證了該模型的有效性。

關(guān)鍵詞：三七（ Panax notoginseng）莖葉;ZTCI+IⅡ型澄清劑;皂苷含量;固形物去除率;響應(yīng)面法

中圖分類號：S853

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 20-0150-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.034

三七（Panax notoginsengJ莖葉是植物三七的莖葉，用于鎮(zhèn)痛止血、消腫化瘀等。其主要成分為皂苷，含有人參皂苷Rb3、C-Mxl、Rbl、Rc等幾十種皂苷[1，2]。Guo等[3]從中分離到54個成分，其中，25個組分中富含皂苷。三七莖葉毒副作用小，能夠治療酒精肝[4]、肥胖癥[5]、心腦血管疾病等，且能抑制芳香化酶的活性[6]。

三七莖葉雖富含多種活性成分，但是蛋白質(zhì)、淀粉等雜質(zhì)可干擾后期的分離，水提醇沉法較常用于去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，但消耗乙醇量大，成本高，且費時費力，能導(dǎo)致有效成分的流失。絮凝澄清法通過利用澄清劑的凝聚和絮凝作用，以吸附架橋和電中和的方式除去溶液中的粗粒子，是精制和提高制劑穩(wěn)定性及澄明度的一種新方法，ZTCl+IⅡ型天然澄清劑是一種較好的絮凝澄清劉[7，8]目前，雖有關(guān)于殼聚糖、明膠、ZTCI+IⅡ澄清劑等澄清三七莖葉水煎液的報道[9]，但考察因素少，試驗設(shè)計簡單。相較于正交設(shè)計，響應(yīng)面法（ Response surface method，RSM）能設(shè)計非線性模型，創(chuàng)建二次回歸方程，具備試驗設(shè)計全面、預(yù)測精度高等優(yōu)點，本研究通過響應(yīng)面設(shè)計探討優(yōu)化三七莖葉皂苷提取液的澄清劑除雜工藝，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

日立紫外可見分光光度計U-2910，購自天美（中國）科學(xué)儀器有限公司;三七莖葉、ZTCI+I-Ⅱ型澄清劑、乙酸、高氯酸、香草醛等均購自揚(yáng)州科能生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 三七莖葉皂苷提取液的制備稱取三七莖葉200 9，置于燒杯中.以10倍量的去離子水加熱回流提取3次，第1次2.0 h，第2、第3次各1.5 h，每次用綢布過濾熱的提取液，濾過殘渣，把3次提取液合并，濃縮，定容500 mL，即為三七莖葉皂苷提取液，此時的藥液質(zhì)量濃度為0.4 g/mL。

1.2.2 天然澄清劑的配制 組分A的配制：稱取5 gA組分，用少量去離子水?dāng)嚦珊隣睿偕倭慷啻渭尤ルx子水使其定容至500 mL，溶脹24 h，充分?jǐn)嚢杈鶆颍秒p層紗布過濾，得到1%黏膠液。

組分B的配制：稱取5gB組分，加入少量1%醋酸，攪拌成糊狀，以1%醋酸少量多次定容至500mL，溶脹24 h，充分?jǐn)嚢杈鶆?，以雙層紗布過濾，即得1%黏膠液[10]。

1.2.3 皂苷對照品溶液的配制 將三七皂苷Rg，標(biāo)準(zhǔn)品在60℃下干燥至恒重，取2.51mg置于容量瓶中，以甲醇溶液溶解，定容至25 mL，搖勻，得對照品溶液，含量為0.100 4 mg/mL。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備按文獻(xiàn)[11]中的香草醛一高氯酸法測定皂苷含量，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5皂苷保留率的測定取澄清前后提取液，按照“1.2.4”方法進(jìn)行定量測定，皂苷保留率=澄清后皂苷的量/澄清前皂苷的量。

1.2.6固形物去除率的測定精密移取澄清前和澄清后的提取液各15 mL，放在已經(jīng)干燥處理好的蒸發(fā)皿中，置于105℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干3h，之后放于37℃恒溫干燥箱中冷卻30 min，快速稱其重量，計算其固形物的去除率（ Y1） [12]。

Y1=（澄清前固形物的量一澄清后固形物的量）/澄清前固形物的量

1.2.7 綜合評分（Overall desirability，OD） 提取液中加入澄清劑進(jìn)行除雜，不僅需要最大限度地減少皂苷有效成分的損失，還要保證良好的澄清效果，所以選擇固形物去除率（Y1）和皂苷保留率（ Y2）一起作為評價性指標(biāo)進(jìn)行綜合性的評分，將Y1的權(quán)重設(shè)定為0.3，Y2的權(quán)重設(shè)定為0.7，按下列公式進(jìn)行計算。OD=（Y1/Y1maxx0.3+ Y2/Y2max0.7）[10].

1.3 除雜工藝單因素的考察

ZTC天然澄清劑不需要調(diào)節(jié)待處理溶液pH，主要根據(jù)溶液的性質(zhì)選擇不同的添加順序，先加入的組分用量與后加入的組分用量比為2：1[13]。由于三七莖葉皂苷提取液pH=5.8，相對于蛋白質(zhì)等電點pH =4.8為堿性環(huán)境，因此加入順序為先B組分后A組分。

按單因素設(shè)計試驗，分別以A、B、C、D代表藥液質(zhì)量濃度[生藥（g）：藥液（mL）]、澄清劑用量（%，以組分B占三七莖葉皂苷提取液的體積比表示）、作用溫度和攪拌時間。取適量三七莖葉皂苷提取液原液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.08、0.11、0.14、0.17、0.20 g/mL的提取液，每份20 mL，在50℃下按照2：1比例依次加入8%、4%體積比的組分B、組分A，充分?jǐn)嚢?0 min后放入水浴鍋中50℃保溫th，之后放置在室溫下靜置12 h，離心，過濾，定容至25 mL，測定其固形物去除率以及皂苷保留率[14]。固定4為0.17 g/mL，分別設(shè)B為4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，C為30、40、50、60、70、80℃，D為10、20、30、40、60 min，按上述方法進(jìn)行試驗。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Design-Expert設(shè)計原理，以4、B、C3個因素作為自變量，進(jìn)行試驗因素和水平設(shè)計，如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

建立y=0.369 5x-0.070 9，R=0.993 8的方程。y為吸光度，x表示標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，表明x在0.024 26-0.121 65mg/mL，存在良好線性關(guān)系。2.2單因素試驗結(jié)果與分析

A、B、C、D對澄清劑除雜效果的影響見表2至表4。由表2至表4可知，A、B、C對OD的影響較大，隨著A的降低和B、C的增加，OD均呈先增大后降低的趨勢。經(jīng)試驗測定發(fā)現(xiàn)，不同攪拌時間對澄清效果影響不大，對固形物去除率及皂苷保留率影響大小相差甚微，因而因素D對除雜工藝的影響可忽略。結(jié)合提取效率及工業(yè)生產(chǎn)的需要，擬將A設(shè)置0.14、0.17、0.20 g/mL 3個水平，B、C取最佳值為中間水平建立模型進(jìn)行研究。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗與分析

2.3.1 模型的建立及方差分析以A、B、C為考察因素，以O(shè)D作為評價指標(biāo)，按照3因素3水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗，按“1.3”的方法進(jìn)行，響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果、方差分析結(jié)果分別見表5、表6。

以Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，得響應(yīng)值（Y）對編碼自變量的二次多項回歸方程為Y=81.26 - 0.6IA+ 2.53B - 4.79C+ 0.13AB - 4.77AC -3.OIBC - 2.2IA2+ 0.4282+ 0.32C2。對該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗，由表6可知，F(xiàn)為8.59，概率P=0.004 9<0.01，說明模型顯著;模型的確定系數(shù)R2adj為0.810 2，說明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系顯著，響應(yīng)值的變化有81.02%來源于所選自變量;同時，模型失擬項F為1.53，概率P>0.05，可知失擬項不顯著，表明該方程試驗誤差小，擬合情況較好。由此可得，擬合情況中的回歸方程良好，因此可用回歸模型代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。對響應(yīng)值作用顯著的是因素B、C、A與C、B與C，說明B、C對響應(yīng)值的影響較大，A與C、B與C之間有較強(qiáng)的交互作用。

2.3.2 等高線與響應(yīng)面結(jié)果與分析 由二次多項回歸方程，分別固定因素C，取中間值50℃;固定因素B，取中間值8%;固定因素A，取中間值0.17 g/mL，可作出A與B、A與C、B與C之間的等高線和響應(yīng)面，如圖l所示。響應(yīng)曲面的陡峭程度反映了不同試驗因素對結(jié)果的影響程度，曲面越陡峭，說明該因素對試驗結(jié)果影響大，反之，則對試驗結(jié)果影響小。由圖1（a1）可知，A與B之間作用平緩。由圖l（b1）、圖1（c1）可知，固定因素A，其OD均隨著因素C的增高而呈先增高后降低的趨勢，固定因素B，其OD均隨著因素C的增高呈逐漸降低的趨勢，且曲面變化非常陡峭，說明A與C、B與C之間存在強(qiáng)烈的交互作用，其中，因素B、因素C對結(jié)果的影響較為顯著。

2.4 最佳提取工藝及驗證試驗

由Design-Exper 8.0.6軟件進(jìn)行嶺脊分析，以回歸模型進(jìn)行預(yù)測，得出最佳工藝條件：4為0.19 g/mL，B為10%，C為40℃。為驗證預(yù)測結(jié)果的真實性，在此工藝條件下進(jìn)行三七莖葉除雜工藝的優(yōu)化，重復(fù)3次試驗，結(jié)果表明，固形物去除率平均值為28.40%，皂苷保留率平均值為92.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.74%和0.56%，驗證了該模型的有效性。

3 討論

3.1 回歸模型建立

本研究采用由Box等[15]提出的響應(yīng)面法，將數(shù)學(xué)建模和試驗設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化，回歸擬合整體因素與結(jié)果的函數(shù)關(guān)系，取得各因素最優(yōu)水平值[16]。該方法試驗周期短、試驗次數(shù)少、精密度高，已廣泛應(yīng)用于制藥、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域[17.18]。王冬東等[19]、萬丹娜等[20]采用響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化中藥黃莪凝膠、山楂的提取、除雜工藝優(yōu)化等取得了較好的效果。正交試驗不能獲得因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)表達(dá)式，不能保證一定可獲得最優(yōu)方案和最優(yōu)值，且水平數(shù)量較多時，試驗次數(shù)多，實施較困難。本研究以三七莖葉為原料，采用澄清劑除雜工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6軟件，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了三七莖葉澄清劑的除雜工藝，回歸分析表明該回歸模型具有很高的準(zhǔn)確性和可信度，可用于三七莖葉水提液澄清劑除雜的預(yù)測與分析。

3.2 ZTCl+1 11型天然澄清劑的除雜原理及優(yōu)點

ZTCI+IⅡ型天然澄清劑由A、B兩種組分組成，為天然多糖等原料中提取的天然高分子物質(zhì)，采用電荷及“架橋”、再“架橋”原理起到澄清的作用。先加入的組分起主絮凝作用，使不同可溶性大分子通過“架橋”連接而使分子迅速增大;后加入的組分起輔助絮凝作用，在第一組分形成的復(fù)合物上再“架橋”，使其盡快形成沉淀。能有效去除蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、果膠、淀粉、黏液質(zhì)等大分子物質(zhì)，保留生物堿、皂苷類、多糖類、黃酮類等有效成分。經(jīng)其處理可得理想的澄明度，對藥材有效成分無質(zhì)量分析上的影響。其還具有經(jīng)濟(jì)適用、安全性好、操作簡單等特點，在天然植物提取除雜及有效成分純化精制方面具有較高的優(yōu)勢[21]。

3.3 三七莖葉提取除雜工藝

近年來，相關(guān)學(xué)者通過澄清劑法、水提醇沉法等對三七莖葉的除雜工藝進(jìn)行了一定的研究。潘育方等[9]應(yīng)用殼聚糖對三七莖葉的煎煮液進(jìn)行澄清工藝試驗，得到最佳工藝為室溫下以0.075 g/100 mL的比例將殼聚糖加到三七水提液中絮凝;張志信等[22]應(yīng)用明膠澄清劑，以黃酮含量為檢測指標(biāo)，對三七莖葉水提取液進(jìn)行澄清工藝研究，其最佳提取工藝為室溫下以提取液體積的0.9%添加澄清劑，靜置2d，調(diào)節(jié)pH為6;李維莉等[23]采用酸水提取法、膜一樹脂聯(lián)用技術(shù)提取并分離純化三七葉苷，并對醇沉法、自然沉降法、無機(jī)陶瓷膜微濾法、無機(jī)陶瓷膜一樹脂法、ZTC I+IⅡ型天然澄清劑法等純化方法進(jìn)行考察，結(jié)果證明，HPD 100大孔吸附樹脂與無機(jī)陶瓷膜分離聯(lián)用技術(shù)效果較好。上述各種方法都有純化除雜作用，除雜率以膜一樹脂法的最高，達(dá)80%以上。損失率以醇沉法最高，達(dá)30%左右。

上述研究均未通過相關(guān)正交或響應(yīng)面設(shè)計等建立模型并進(jìn)行試驗驗證，其工藝是否最佳缺乏相關(guān)依據(jù)。雖以除雜率、澄清度、有效成分含量等為檢測指標(biāo)，但未有綜合考查指標(biāo)如綜合評分法等，結(jié)果判定缺乏周密性，雖然膜分離法效果較好，但濾膜抗污染能力差、壽命短，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化澄清劑除雜工藝，皂苷保留率大于92%，固化物的去除率大于28%，優(yōu)于上述大部分研究。

綜上所述，本研究建立模型得出的最佳工藝，固形物去除率和皂苷保留率較高，RSD較小，重現(xiàn)性較好。此模型的建立可為三七莖葉皂苷的提取精制及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考。

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作者簡介：秦楓（1979-），女，山東煙臺人，在讀博士研究生，副教授，主要從事天然藥物研發(fā)，（電話）13961041602（電子信箱）qinancy922@163.com;通信作者，朱善元（1967-），男，江蘇泰州人，教授，博士，主要從事生物技術(shù)的研究，（電話）0523-86158001（電子信箱）jstzzsy@126.com。