香葉提取物抗氧化及抗疲勞研究

王少娟，王志英

(1.河南水利與環(huán)境職業(yè)學(xué)院，鄭州 450008；2.黃河科技學(xué)院，鄭州 450063)

1 概述

香葉是天竺葵的莖和葉，在我國(guó)被廣泛栽培，具有特殊的芳香氣味，其主要成分包括香葉醇、香茅醇和芳樟醇等[1-2]。香葉作為調(diào)味劑在日常生活中被廣泛運(yùn)用，也被醫(yī)療行業(yè)用于祛風(fēng)、祛濕和止痛[3]。香葉中除了含有芳香揮發(fā)油之外，還含有豐富的黃酮和多糖類成分，而黃酮具有抗氧化、抗疲勞、消炎、降血壓和提高機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)功能。

近年來也發(fā)現(xiàn)香葉精油提取物對(duì)動(dòng)物腫瘤細(xì)胞具有明顯的療效。通過對(duì)體外癌細(xì)胞抑制生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)香葉提取物具有明顯的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果，擁有作為抗癌新藥開發(fā)的潛力。2015年，段宙位等[4]報(bào)道香葉油對(duì)宮頸癌具有較好的療效；2016年，潘軍輝等[5]也指出香葉油對(duì)宮頸癌有較好的療效。此外，香葉在抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)方面也具有很好的療效，對(duì)致病性和非致病性細(xì)菌具有廣譜殺菌和抑菌作用[6-7]。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

香葉干浸膏、維生素C、DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基、超氧陰離子、鄰苯三酚、鹽酸、磷酸、蒸餾水、過氧化氫、硫酸鐵、水楊酸乙醇、亞硫酸鉀、蘆丁、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、纖維素酶。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、分析天平、真空泵、烘箱、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

稱取適量的香葉干浸膏，用濃度為50%的無水乙醇制備濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，將5種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液分別取2 mL加入到5個(gè)比色管中，再加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，搖勻，放置0.5 h，在517 nm處測(cè)定吸光度值為A樣品。在5個(gè)比色管中加入上述5種濃度的香葉，然后加入無水乙醇2 mL，搖勻，放置0.5 h，在517 nm處測(cè)定吸光度值為A對(duì)照。其他條件不變，將香葉溶液變?yōu)檎麴s水，測(cè)定的吸光度值為A空白。稱取適量的維生素，按照上述方法，獲得維生素C的吸光度值。通過下式計(jì)算香葉樣品溶液和維生素C的DPPH·清除率[8-9]。

DPPH·清除率(%)=[(A空白-A樣品+A對(duì)照)/A空白]×100。

2.3.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

將ABTS制成7 mol/L的溶液，亞硫酸鉀制成4.8 mol/L的溶液，二者進(jìn)行等體積的混合，將溶液放置于室內(nèi)避光12 h，制成實(shí)驗(yàn)所用的ABTS自由基溶液[10-11]。將ABTS自由基溶液制成吸光度值為0.600±0.01的工作液加入6支不同的比色管中，在2組6支ABTS自由基溶液中分別添加濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的香葉提取物和維生素C溶液，搖勻，在室溫條件下放置6 min，在波長(zhǎng)為734 nm的條件下測(cè)定吸光度值，通過下式計(jì)算ABTS自由基的清除率[12]。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

式中：A1為加入不同濃度的香葉提取物的吸光度值，A2為等體積的蒸餾水代替ABTS自由基的吸光度值，A0為等體積的樣品蒸餾水代替樣品的吸光度值。

2.3.3 羥自由基清除實(shí)驗(yàn)

配制濃度為9 mol/L的硫酸鐵和水楊酸乙醇溶液和8.8 mol/L的過氧化氫。準(zhǔn)備濃度為5，10，15，20 mg/mL的香葉提取物和醋酸[13]。按照硫酸鐵、水楊酸乙醇溶液和過氧化氫溶液的順序分別添加1 mL溶液，在室溫條件下放置1 h，在510 nm處測(cè)定吸光度。對(duì)羥自由基的清除率見下式。

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

式中：A1為加入不同濃度的香葉提取物的吸光度值，A2為等體積的蒸餾水代替過氧化氫的吸光度值，A0為等體積的樣品蒸餾水代替樣品的吸光度值。

2.3.4 超氧陰離子清除實(shí)驗(yàn)

取濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖溶液3.5 mL，添加1 mL蒸餾水，最后加入0.5 mL濃度為10 mol/L的鄰苯三酚溶液，搖勻，1 min后在波長(zhǎng)為325 nm處測(cè)定吸光度A1，之后隔1 min記錄一次A2數(shù)據(jù)一直記錄到5 min，陰離子清除率穩(wěn)定，使用濃度為10 mol/L的鹽酸作為鄰苯三酚溶液的空白對(duì)照來計(jì)算鄰苯三酚的自氧化速率(S1)[14-16]。分別使用濃度為5，10，15，20 mg/mL的香葉提取物和醋酸溶液，按照上面的操作方法，測(cè)定實(shí)驗(yàn)后的溶液吸光度，同時(shí)計(jì)算加樣后的鄰苯三酚自氧化速率[17-18]。

S0=(A2-A1)/3,

超氧陰離子清除率(%)=[(S0-S1)/S0]×100。

式中：S0為鄰苯三酚自氧化速率，A2為第5 min時(shí)的吸光度值，A1為第1 min時(shí)的吸光度值，S1為加入香葉提取物后的自氧化速率。

3 香葉提取物抗氧化活性研究

3.1 DPPH自由基清除率

圖1 維生素C和香葉提取物對(duì)DPPH·的清除率Fig.1 The scavenging rate of vitamin C and Geranium extract on DPPH·free radicals

由圖1可知，隨著維生素C和香葉提取物溶液質(zhì)量的增加，DPPH·的清除率均逐漸升高，維生素C和香葉提取物對(duì)DPPH·的清除率均與二者的溶液質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)溶液質(zhì)量濃度低于0.5 mg/mL時(shí)，維生素C的DPPH·清除率均高于香葉提取物的DPPH·清除率；當(dāng)溶液濃度大于0.5 mg/mL時(shí)，香葉提取物與維生素C的清除率相接近。香葉提取物對(duì)DPPH·的清除率與質(zhì)量濃度的回歸方程為Y=3.0245+269.2346X，R2=0.8902，香葉提取物的清除率IC50值為(1.12±0.02) mg/mL；維生素C的質(zhì)量濃度對(duì)DPPH·清除率的線性回歸方程為Y=22.2334+187.2365X，R2=0.9961，其IC50值為0.1501 mg/mL。

3.2 ABTS自由基清除率

圖2 維生素C和香葉提取物對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.2 The scavenging rate of vitamin C and Geranium extract on ABTS free radicals

ABTS自由基能夠很好地溶解于水中，經(jīng)常被用于測(cè)定一些天然產(chǎn)物的抗氧化活性，主要是測(cè)定抗氧化劑保持氧化還原的能力。通過使用不同濃度的香葉提取物和維生素C，利用ABTS自由基清除能力的大小來測(cè)定香葉提取物和維生素C的抗氧化活性。由圖2可知，香葉提取物濃度低于20 mg/mL時(shí)，維生素C的抗氧化活性高于香葉提取物的抗氧化活性，當(dāng)香葉提取物濃度高于20 mg/mL時(shí)，維生素C與香葉提取物的ABTS清除率接近100%。

3.3 羥自由基清除率

圖3 香葉提取物和醋酸對(duì)羥自由基的清除率Fig.3 The scavenging rate of Geranium extract and acetic acid on hydroxyl free radicals

羥自由基是目前在生物機(jī)體中已知的一種對(duì)生物體毒性最強(qiáng)的氧自由基，在生物體內(nèi)，能氧化生物體中的多種分子，引起機(jī)體細(xì)胞衰老和死亡，氨基酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等多種物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，從而引發(fā)機(jī)體功能紊亂。由圖3可知，香葉提取物對(duì)羥自由基的清除能力一直高于醋酸對(duì)羥自由基的清除能力。香葉提取物與醋酸對(duì)羥自由基的清除能力隨著二者濃度的增高而提高。

3.4 超氧陰離子清除率

圖4 香葉提取物和醋酸對(duì)超氧陰離子的清除率Fig.4 The scavenging rate of Geranium extract and acetic acid on superoxide anions

超氧陰離子是人機(jī)體內(nèi)一種特殊的自由基，人機(jī)體內(nèi)存在的數(shù)量少，在不接觸羥基時(shí)，對(duì)機(jī)體不能產(chǎn)生損傷，但是與機(jī)體接觸后的產(chǎn)物對(duì)機(jī)體細(xì)胞具有較強(qiáng)的氧化毒害作用，除此之外，超氧陰離子還與人類多種疾病發(fā)生有關(guān)。所以，超氧陰離子的測(cè)定也是香葉提取物抗氧化活性測(cè)定的重要指標(biāo)。由圖4可知，香葉提取物與醋酸溶液二者對(duì)超氧陰離子均存在一定的清除率，且在相同濃度下，香葉提取物對(duì)超氧陰離子的清除率高于醋酸溶液的清除率。

4 香葉提取物抗疲勞作用研究

運(yùn)動(dòng)耐力下降是疲勞的最直接體現(xiàn)，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間是反映運(yùn)動(dòng)耐力的重要指標(biāo)，通過對(duì)不同濃度的香葉提取物和空白對(duì)照小鼠負(fù)重游泳時(shí)間影響的研究，發(fā)現(xiàn)不同濃度的香葉提取物都能提高小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，與空白對(duì)照相比較，10 mg/mL的香葉提取物小鼠負(fù)重游泳時(shí)間提高了47.5%；20 mg/mL提高了69.3%；30 mg/mL提高了118.7%。研究結(jié)果顯示，高濃度的香葉提取物能夠提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

小鼠長(zhǎng)期的激烈運(yùn)動(dòng)，肌肉在缺氧的狀態(tài)下，發(fā)生糖酵解反應(yīng)，產(chǎn)生大量的乳酸，肌肉的乳酸堆積是疲勞產(chǎn)生的主要原因，激烈運(yùn)動(dòng)之后BLA被清除的速度越快，則抗疲勞效果越好。不同劑量的香葉提取物濃度對(duì)運(yùn)動(dòng)后的小鼠的BLA都有一定的抑制作用。游泳前在安靜的狀態(tài)下，香葉提取物對(duì)BLA含量無明顯影響。與空白對(duì)照組比較，30 mg/mL香葉提取物飼喂的小鼠BLA含量在運(yùn)動(dòng)后的0 min和20 min分別降低了7.8%和6.8%。

5 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，香葉提取物具有很好的抗氧化和抗疲勞作用；抗氧化作用是通過清除機(jī)體的DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基和超氧陰離子而實(shí)現(xiàn)抗氧化的功能。無論是機(jī)體的自由基還是超氧陰離子，清除率均與香葉提取物濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，該研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似[19-21]。當(dāng)香葉提取物濃度低于0.5 mg/mL時(shí)，香葉提取物對(duì)DPPH自由基的清除率低于維生素C的清除率；當(dāng)香葉提取物濃度高于0.5 mg/mL時(shí)，香葉提取物對(duì)DPPH自由基的清除率比維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率高。當(dāng)香葉提取物濃度低于20 mg/mL時(shí)，維生素C的抗氧化活性高于香葉提取物的抗氧化活性；當(dāng)香葉提取物濃度高于20 mg/mL時(shí)，維生素C與香葉提取物的ABTS自由基清除率接近100%。香葉提取物對(duì)羥自由基的清除能力一直高于醋酸對(duì)羥自由基的清除能力，香葉提取物與醋酸對(duì)羥自由基的清除能力一直隨著二者濃度的增高而提高。香葉提取物與醋酸溶液二者對(duì)超氧陰離子均存在一定的清除率，隨著香葉提取物和醋酸溶液濃度的提升，二者對(duì)超氧陰離子的清除均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在相同濃度下，香葉提取物對(duì)超氧陰離子的清除率高于醋酸溶液的清除率。相比較維生素C和醋酸，香葉提取物擁有較好的抗氧化活性[22-23]。

近年來，抗疲勞和抗氧化活性研究的食品越來越多，例如辣椒素、陳醋、花椒、百里香和生姜等[24-28]，同時(shí)香葉的抗氧化活性研究也成為研究重點(diǎn)。香葉提取物的抗疲勞作用是通過對(duì)機(jī)體多糖成分中自由基的清除來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度提高，活動(dòng)量增大時(shí)，由于自由基作用而引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致生物體細(xì)胞器受到損傷，引起細(xì)胞代謝的混亂和病理變化，肌肉不能實(shí)現(xiàn)正常的功能，從而產(chǎn)生疲勞[29-30]。除此之外，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增強(qiáng)時(shí)，肌肉中的ATP含量會(huì)下降，經(jīng)過10 s左右，機(jī)體中的葡萄糖能夠通過無氧酵解提供給機(jī)體能量。當(dāng)機(jī)體中血糖濃度低時(shí)，血糖能量供應(yīng)不足，產(chǎn)生疲勞。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含有多糖和黃酮類成分的香葉能增強(qiáng)機(jī)體肝糖原的儲(chǔ)備，從而產(chǎn)生抗疲勞的效果。