不同溶劑提取黑牛肝菌中的多酚及抗氧化活性的比較研究

胡棟寶 羅麗昌 楊 猛 李 琛

（玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南玉溪653100）

牛肝菌是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的統(tǒng)稱，因肉質(zhì)肥厚，極似牛肝而得名，是名貴稀有的野生食用菌，為“四大菌王”之一，主要有白、黃、黑牛肝菌幾種，除少數(shù)品種有毒或味苦而不能食用外，大部分品種均可食用。黑牛肝菌（Boletus aere?us），是一類營養(yǎng)價值很高的野生食用菌，具有抗氧化、抗菌、抗輻射、護(hù)肝、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等活性[1-4]。多酚的有效提取一直是食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前多酚的主要提取方法有溶劑萃取法、超聲提取法、微波提取法、吸附分離提取法等，而常用的提取溶劑主要有甲醇、乙醇、丙酮以及這些溶劑與水的混合溶劑等[5]。不同種牛肝菌由于化學(xué)成分的差異導(dǎo)致其多酚最佳提取溶劑存在差異。如徐勝平等在研究銅色牛肝菌、雙色牛肝菌、美味牛肝菌、灰褐牛肝菌多酚含量時發(fā)現(xiàn)60%乙醇溶液提取的多酚具有較好的抗氧化活性[6]；郭磊等發(fā)現(xiàn)提取美味牛肝菌多酚的最好溶劑為80%的乙醇溶液[7]。目前，有關(guān)提取溶劑對黑牛肝菌多酚的提取率及其抗氧化活性影響的研究鮮見報道。為此筆者比較蒸餾水、70%甲醇、70%無水乙醇、70%丙酮對黑牛肝菌多酚類化合物提取效果的影響，多酚抗氧化活性的差異，旨在為黑牛肝菌食用菌資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

黑牛肝菌采自玉溪市易門縣，干燥粉粹備用。甲醇、乙醇、丙酮、無水碳酸鈉（分析純，四川西隴化工有限公司）；沒食子酸、DPPH 自由基（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、抗壞血酸（分析純，天津市雙船化學(xué)試劑廠）；ABTS[2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸]二銨鹽（分析純，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；福林酚（分析純，上海金穗生物科技有限公司）；過硫酸鉀、磷酸氫二鈉（分析純，天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司）；磷酸二氫鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；三氯乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003 型分析天平，上海精天電子儀器；H2-16K 臺式高速微量離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；SHZ-DⅢ予華牌循環(huán)水真空泵，河南鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-2700 紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑牛肝菌不同溶劑提取物的制備

將黑牛肝菌自然晾干，粉碎，過60 目篩。準(zhǔn)確稱取0.5 000 g 黑牛肝粉末放置于錐形瓶中，分別加70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮、蒸餾水，置于超聲波清洗儀中提取30 min，提取物保存?zhèn)溆肹8]。

1.3.2 黑牛肝菌多酚含量的測定

采用酚林酚法測定黑牛肝菌多酚含量：精確稱取0.005 g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，蒸餾水溶解，定容至50 mL，得0.1 mg／mL 標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確量取上述標(biāo)準(zhǔn)液（mL）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 于 50 mL 容量瓶中，各加30 mL蒸餾水，搖勻，再加2.5 mL福林試劑，充分搖勻，1 min之后，加入10%碳酸鈉溶液7.5 mL，混勻定容，60 ℃水浴反應(yīng)10 min，于760 nm 波長下測定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取0.5 mL 多酚提取液代替沒食子酸溶液，按上述方法測定其吸光度并計(jì)算其多酚的含量[9]。

1.3.3 清除DPPH自由基能力的測定

稱取一定量的DPPH 自由基，用無水乙醇溶解，配制成0.20 mmol/L 溶液。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品2 mL與2 mL DPPH自由基溶液混勻，25 ℃水浴中保溫30 min。以無水乙醇為對照，于517 nm 測定吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算黑牛肝菌提取物對DPPH自由基的清除率[9-10]：

DPPH自由基清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中：A1，對照樣吸光度值；A2，樣品吸光度值。

以樣品為自變量、自由基清除率為因變量作圖。IC50值為清除率50%時所需的濃度，所需濃度越低，則該物質(zhì)的抗氧化性越強(qiáng)。

1.3.4 清除ABTS陽離子自由基能力的測定

取4.00 mL ABTS 陽離子自由基溶液，置于10 mL 比色管中，分別加入1.00 mL 不同濃度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL）的樣品液或 VC 溶液，反應(yīng)10 min。以無水乙醇為參比，調(diào)零，在734 nm處測定其吸光度A2，用無水乙醇代替樣品液做空白對照[10]。試驗(yàn)重復(fù)3 次。計(jì)算對ABTS 陽離子自由基清除率：

ABTS陽離子自由基清除率=（A1-A2）/A1×100%

式中：A1，空白對照的吸光度；A2，樣品液或VC溶液的吸光度。

以樣品為自變量、自由基清除率為因變量做圖，IC50值為清除率50%時所需的濃度，所需濃度越低，則該物質(zhì)的抗氧化性越強(qiáng)。

1.3.5 鐵還原能力測定

鐵還原能力測定采用Oyaizu 的方法[11-12]并稍做修改。移取1.0 mL提取液加入10 mL具塞帶有刻度的試管中，再加入2.5 mL 濃度為0.2 mol/L 磷酸緩沖液，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，50 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL終止反應(yīng)取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水，0.1%FeCl3溶液 0.5 mL 混勻，反應(yīng) 10 min，于波長 700 nm 處測定吸光度。以吸光度來表示還原能力的大小，吸光度越大，說明還原能力越強(qiáng)[7]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均用Origin 8.5 軟件處理作圖，并采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測量數(shù)據(jù)均以 Mean±S.D.表示，P<0.05 認(rèn)為有顯著差異，P<0.01認(rèn)為具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，760 nm 下測定的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=106.26x+0.012 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 7，表明線性相關(guān)良好，可作為多酚含量測定的方法[8]。

2.2 供試四種溶劑提取物多酚的含量

分別用4種溶劑水、體積百分?jǐn)?shù)70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮為提取溶劑提取黑牛肝菌中的多酚并測定其中的多酚含量，不同溶劑提取的多酚具有一定差異，其中四種不同溶劑提取的多酚含量均有顯著性差異（P<0.05）。由表1 可知，體積百分?jǐn)?shù)為70%丙酮溶液提取效果最佳，其次是體積百分?jǐn)?shù)70%甲醇、70%乙醇，蒸餾水提取效果最差，其可能原因黑牛肝菌中的多酚物質(zhì)類型屬于中等極性的物質(zhì)。

表1 供試四種溶劑黑牛肝菌多酚提取物的吸光度值及提取量

2.3 清除DPPH自由基能力

對DPPH 自由基清除能力的大小是抗氧化性強(qiáng)弱的評價指標(biāo)之一[13]。由圖1 可以看出，黑牛肝菌四種溶劑提取物對DPPH 自由基的清除能力都較強(qiáng)，其中70%丙酮溶液提取物的DPPH 自由基清除率除丙酮濃度在0.1 mg/mL 時低于70%甲醇溶液外，其余均比其他溶劑清除率要高，說明多酚抗氧化活性受提取溶劑極性大小的影響，黑牛肝菌抗氧化物質(zhì)主要分布在中等極性溶劑中，在極性溶劑如水中分布最少；隨著提取物多酚濃度的增加，其對DPPH 自由基的清除能力也增強(qiáng)，但其變化趨勢逐漸趨于平緩。黑牛肝菌中的多酚是一類抗氧化性的化合物，DPPH 自由基清除能力與多酚的含量呈現(xiàn)出很好的正相關(guān)性[14]。IC50為半數(shù)抑制率濃度，即為自由基清除率達(dá)到50%時的濃度，其濃度越低，則該物質(zhì)的抗氧化性越強(qiáng)。根據(jù)清除率擬合曲線，70%甲醇：y=1.816x+0.780；70% 乙 醇 ：y=1.484x+0.811 8；70% 丙 酮 ：y=0.476x+0.907 9；蒸餾水：y=1.549 5x+0.715 8；VC：y=0.815x+0.675 7，其中VC 作為對照。經(jīng)線性擬合，由表2 可以看出，五種溶劑（70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮、蒸餾水、VC）提取液的IC50值分別為（0.029 9±0.003）mg/mL、（0.035 0±0.005）mg/mL、（0.024 1±0.006）mg/mL、（0.046 4 ± 0.005）mg/mL、0.032 0 ±0.002 mg/mL，即DPPH 自由基清除排序?yàn)?0%丙酮>70%甲醇>VC>70%乙醇>蒸餾水，其中70%丙酮與70%甲醇提取物抗氧化活性均強(qiáng)于VC，說明黑牛肝菌可以作為一種尋求天然抗氧化劑的資源。

圖1 清除DPPH自由基能力

表2 多酚對自由基清除率和鐵離子還原能力的回歸結(jié)果

2.4 清除ABTS陽離子自由基能力

與DPPH 自由基類似，供試溶劑黑牛肝菌提取物都具有較好的ABTS 陽離子自由基清除活性。其清除能力與濃度呈正相關(guān)。清除率越高說明其抗氧化活性越強(qiáng)。隨著提取物多酚濃度的增加，其對ABTS 陽離子自由基的清除能力也增加，并且隨著多酚濃度的升高其變化趨勢大體逐漸趨于平緩。ABTS 陽離子自由基清除能力與多酚的含量呈現(xiàn)出很好的正相關(guān)性[12-15]。

ABTS 陽離子自由基與抗氧化劑反應(yīng)后溶液發(fā)生褪色，溶液褪色越明顯，則表明所檢測物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。ABTS 陽離子自由基的清除能力的大小是抗氧化性強(qiáng)弱的評價指標(biāo)之一[15]。根據(jù)清除率擬合曲線，70%甲醇：y=2.766x+0.605 2；70%乙醇：y=0.911 5x+0.644 5；70%丙酮：y=0.546x+0.751；蒸餾水：y=2.303x+0.486 7；VC：y=2.202x+0.656，其中VC 作為對照。經(jīng)線性擬合，由圖2 可知，不同溶劑提取物中，70%乙醇提取物的DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)，當(dāng)濃度在0.1 mg/mL 時，清除率為94.87%。由表2 可知，五種溶劑（70%甲醇，70%乙醇，70%丙酮，蒸餾水，VC）提取液的IC50值分別為：（0.017 4±0.008）mg/mL、（0.009 7±0.007）mg/mL、（0.023 9±0.001）mg/mL、（0.031 6±0.003）mg/mL、（0.015 6±0.004）mg/mL，不同溶劑提取液對DPPH 自由基清除率能力不同，70%乙醇>VC>70%甲醇>70%丙酮>蒸餾水，可能是由于抗氧化體系不同導(dǎo)致[16-18]。

圖2 清除ABTS陽離子自由基能力

2.5 還原 Fe3+能力

供試溶劑提取物中多酚含量對鐵離子還原能力的結(jié)果見圖3。不同的吸光度代表其抗氧化性能力強(qiáng)弱，吸光度越大代表還原能力越強(qiáng)。由圖3 可知，吸光度與多酚濃度呈正比，隨著提取物中多酚含量的增加，其吸光度也增大，還原力也越強(qiáng)[19-20]。根據(jù)清除率擬合曲線，70%甲醇：y=7.935x+0.056 3，R2=0.951 5；70%乙 醇 ：y=10.315x +0.207 9，R2=0.991 7；70%丙酮：y=7.985x+0.056 3，R2=0.968 0；蒸餾水：y=7.280x+0.192 4，R2=0.955 5；VC：y=7.195x+0.269 7，R2=0.965 4，其中 VC 作為對照。由表2 知，經(jīng)線性擬合，黑牛肝菌供試溶劑多酚提取物EC50值，70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮、蒸餾水、VC 分別為：（0.056 2±0.002）mg/mL、（0.033 7±0.003）mg/mL、（0.033 9±0.005）mg/mL、（0.047 2±0.006）mg/mL、（0.040 2±0.006）mg/mL。供試溶劑提取物的還原能力排序?yàn)?0%乙醇>70%丙酮>VC>蒸餾水>70%甲醇，這說明黑牛肝菌有較強(qiáng)的抗氧化性[20]。由圖3可知，供試溶劑提取物多酚含量相同其抗氧化活性越不同，說明抗氧化活性還受提取溶劑的影響。黑牛肝菌多酚抗氧化物質(zhì)主要分布在中等極性溶劑中，在極性溶劑中分布較少。

綜合三種抗氧化活性數(shù)據(jù)可以看出，70%丙酮的黑牛肝菌多酚提取物對自由基的清除能力都較強(qiáng)，黑牛肝菌多酚提取物具有好的體外抗氧化活性，是一種潛在的天然食品抗氧化劑。

圖3 還原Fe3+能力

3 小結(jié)

采用不同溶劑提取黑牛肝菌中的多酚，進(jìn)行三種抗氧化活性測定，分析其抗氧化活性的差異。結(jié)果表明，以70%丙酮、70%甲醇、70%乙醇、蒸餾水作為提取溶劑時，所得多酚含量分別為（10.4±0.055）mg/g、（9.6±0.034）mg/g、（8.8±0.022）mg/g、（8.0±0.036）mg/g；多酚含量與抗氧化活性相關(guān)性較高;多酚濃度越高其抗氧化性越強(qiáng)，不同溶劑提取物對DPPH 自由基、ABTS 陽離子自由基都具有很好的清除能力，且清除能力與多酚濃度呈良好的線性關(guān)系，對鐵離子具有很好的還原能力。抗氧化物質(zhì)主要分布在中等極性溶劑中，在極性溶劑中分布較少。