豬APOA2 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子GATA1 作用的研究

張 鳳，李 鑫，陳 昆，陳明新

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070；3.武漢市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，武漢 430023）

肌內(nèi)脂肪影響肉質(zhì)感官品質(zhì)性狀（嫩度、多汁性、風(fēng)味等），且與胴體品質(zhì)強(qiáng)烈相關(guān)，因此在生產(chǎn)中肌內(nèi)脂肪含量常被用作肉質(zhì)遺傳改良的一個(gè)重要指標(biāo)［1］。脂肪代謝在肌內(nèi)脂肪沉積過程中發(fā)揮重要作用，肌內(nèi)脂肪沉積是脂肪合成代謝與分解代謝動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果，當(dāng)合成代謝與分解代謝不同步時(shí)，原來的平衡狀態(tài)就會被破壞，致使脂肪沉積量的變化。當(dāng)脂肪合成多于分解時(shí)，脂肪沉積量會增加；相反，當(dāng)脂肪合成少于分解時(shí)，脂肪沉積量就會減少。高密度脂蛋白（High-density lipoprotein，HDL）是血清蛋白質(zhì)的重要組成部分，在脂質(zhì)代謝和膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用［2］。載脂蛋白A-Ⅱ（Apolipoprotein AII，APOA2）為載脂蛋白A 家族成員，是構(gòu)成高密度脂蛋白十分重要的載脂蛋白，直接決定其結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性［3，4］。已有研究報(bào)道，APOA2 基因與人類內(nèi)臟脂肪積聚和富含甘油三酯的脂蛋白代謝有關(guān)［5］，且影響人類的肥胖及2 型糖尿?。?-8］。在小鼠中，APOA2 蛋白參與游離脂肪酸與甘油三酯代謝，并且缺乏APOA2 蛋白會增加動(dòng)脈硬化及胰島素過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［9］。在豬中，APOA2 基因與背膘厚顯著相關(guān)［10］。據(jù)此，推測APOA2 基因可能通過調(diào)控豬脂肪代謝進(jìn)而影響肌內(nèi)脂肪沉積。本研究首先通過PCR 擴(kuò)增獲得7 個(gè)逐級缺失的豬APOA2 基因啟動(dòng)子片段，且連接至pGL3-Basic 雙熒光素酶報(bào)告載體，構(gòu)建7 個(gè)啟動(dòng)子缺失載體；然后經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞分析熒光活性確定核心啟動(dòng)子區(qū)域；最后進(jìn)行生物信息學(xué)分析、過表達(dá)、結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變等，研究轉(zhuǎn)錄因子GATA1 對APOA2 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究APOA2 基因調(diào)控豬肌內(nèi)脂肪沉積的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

腦、心臟、脾臟、背最長肌、小腸、腎臟、腓腸肌、肺臟、舌、肝臟、脂肪、胃等組織樣品取自4 月齡純種大白豬，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)精品豬場提供；Xho I 及Mlu I 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶，NEB 公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，北京全式金生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1（+）過表達(dá)載體、LipofectamineTM2000 及Trizol 試 劑，Invitrogen 公 司；Prime-Script—RT reagent Kit with gDNA Eraser、pMD-18T 載體及TaKaRa MutanBEST Kit，寶生物工程（大連）有限 公 司；Dual-Luciferase?Reporter Assay System、pGL3-Basic 及pRL-TK，Promega 公司；Gel Extraction kit、Plasmid Mini KitI 及E. Z. N. A.?Endo-Free Plasmid Mini Kit II，Omega 公司；Opti-MEM，Gibco公司；SYBRGreen I 熒光染料及CFX96 儀器，Bio-Rad 公司；DMEM/F-12 1∶1、DMEM 高糖培養(yǎng)基及PBS，Hyclone 公司；細(xì)胞系為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬APOA2 基因空間表達(dá)譜構(gòu)建 采集4 月齡純種大白豬的脾臟、心臟、腦、背最長肌、小腸、腎臟、腓腸肌、肺臟、舌、肝臟、脂肪、胃等組織，放入液氮進(jìn)行急凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。上?2 個(gè)樣品經(jīng)液氮研磨利用Trizol 法提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以豬β-actin（表1）為看家基因，利用SYBR Green Ⅰ熒光染料，在CFX96 儀器中進(jìn)行豬APOA2 基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）反應(yīng)，原始數(shù)據(jù)經(jīng)2-——CT法進(jìn)行分析。

1.2.2 豬APOA2 基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建 提取NCBI 數(shù)據(jù)庫中豬APOA2 基因的序列信息（Gene ID：100153243），針對其5′端上游序列設(shè)計(jì)7 條上游引物（APOA2-F1～APOA2-F6）和1 條下游引物（APOA2-R）（表2）。以豬基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增獲得7 條逐級縮短的啟動(dòng)子片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收、純化，獲得目的片段并連接至pMD-18T 載體；提取質(zhì)粒與pGL3-Basic 載體質(zhì)粒一同經(jīng)Mlu I 和Xho I 37 ℃雙酶切消化2 h；再次經(jīng)凝膠電泳回收、純化后用T4DNA 連接酶于16 ℃過夜；轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α 中、挑菌；測序成功后擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提；測定質(zhì)粒濃度并雙酶切鑒定成功后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。此外，通過對APOA2 基因各缺失片段熒光活性的分析，推測-813～-565 區(qū)域內(nèi)可能存在一個(gè)或多個(gè)正向調(diào)控元件。因此，對上述區(qū)域再次進(jìn)行缺失，引物為2-APOA2-F1～2-APOA2-F5（表2），下游引物不變。

表2 APOA2 基因啟動(dòng)子缺失片段擴(kuò)增引物序列

1.2.3 轉(zhuǎn)錄因子GATA1 結(jié)合位點(diǎn)突變載體構(gòu)建以2-APOA2-5 質(zhì)粒為模板，依據(jù)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子GATA1 的結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表3），利用MutanBEST Kit 試劑盒對此結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。

表3 轉(zhuǎn)錄因子GATA1 結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變引物序列

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及熒光活性分析 細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM 中加入10% 胎牛血清，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞復(fù)蘇后，待培養(yǎng)至90% 融合度時(shí)，經(jīng)胰酶消化并均勻接種于24 孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞長至90% 時(shí)利用LipofectamineTM2 000 脂質(zhì)體對各啟動(dòng)子片段質(zhì)粒分別進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。每孔細(xì)胞中加入0.5 μg 啟動(dòng)子質(zhì)粒及0.025 μg pRL-TK 質(zhì)粒（經(jīng)50 μL Opti-MEM 稀釋）；2.0 μL LipofectamineTM2 000 試劑（經(jīng)50 μL Opti-MEM 稀釋）。轉(zhuǎn)染24 h 后經(jīng)Passive lysis buffer 裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，利用PerkinElmer 2030 Multilabel Reader 檢測雙熒光素酶活性。

1.2.5 GATA1 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染試驗(yàn) GATA1 過表達(dá)載體（pcDNA-GATA1）由實(shí)驗(yàn)室保存。將PK-15細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞板中，待長至90% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為試驗(yàn)組和對照組，每組3 次重復(fù)。試驗(yàn)組為0.25 μg 啟動(dòng)子質(zhì)粒、0.025 μg pRL-TK 質(zhì)粒及0.25 μg pcDNA-GATA1 質(zhì)粒，對照組為0.25 μg 啟動(dòng)子質(zhì)粒、0.025 μg pRL-TK 質(zhì)粒及0.25 μg pcDNA3.1（+）空白載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞裂解液并測定雙熒光素酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬APOA2 基因空間表達(dá)譜構(gòu)建

利用Q-PCR 技術(shù)檢測4 月齡大白豬12 個(gè)不同組織中APOA2 基因的表達(dá)量，構(gòu)建空間表達(dá)譜，結(jié)果如圖1 所示。APOA2 基因在各組織中的表達(dá)量差異較大，其中在肝臟組織中的表達(dá)量最高，脂肪組織中次之，其他組織中表達(dá)量較低（圖1）。

圖1 豬APOA2 基因在不同組織中的表達(dá)量

2.2 豬APOA2 啟動(dòng)子雙熒光素酶載體構(gòu)建及活性分析

利用PCR 技術(shù)從大白豬基因組DNA 中擴(kuò)增獲得7 個(gè)長度逐級缺失的APOA2 啟動(dòng)子片段，并連接至pGL3-Basic 雙熒光素報(bào)告載體中，構(gòu)建7 個(gè)啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體，命名為APOA2-1 至APOA2-7。將構(gòu)建的熒光載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，釋放出的片段與預(yù)期結(jié)果相符（圖2），表明載體構(gòu)建成功。

圖2 豬APOA2 基因啟動(dòng)子缺失片段熒光載體質(zhì)粒鑒定

將構(gòu)建成功的7 個(gè)啟動(dòng)子載體質(zhì)粒與pGL3-Basic 質(zhì)粒 分別轉(zhuǎn) 染C2C12、3T3-L1 及PK-15 細(xì)胞，24 h 后測定雙熒光素酶活性。 結(jié)果表明，APOA2-1、APOA2-2、APOA2-3 均具有熒光活性但相對較低；APOA2-4 活性顯著上升，表明-813～-565 bp 區(qū)域內(nèi)可能存在一個(gè)或多個(gè)促進(jìn)APOA2 基因轉(zhuǎn)錄的順式作用元件；APOA2-5 活性降低，表明-1 032～-813 bp 區(qū)域內(nèi)可能存在一個(gè)或多個(gè)抑制APOA2 基因轉(zhuǎn)錄的順式作用元件；APOA2-6、APOA2-7 活性略有回升（圖3）。

圖3 豬APOA2 基因啟動(dòng)子缺失片段熒光活性測定

對APOA2-4 區(qū)域進(jìn)一步構(gòu)建5 個(gè)熒光載體并進(jìn)行活性分析，載體命名為2-APOA2-1 至2-APOA2-5。 雙熒光素酶活性分析結(jié)果表明，2-APOA2-1 活性最高，約為APOA2-3 活性的5 倍（圖4），表明-659～-565 bp 區(qū)域更可能存在順式作用元件。

圖4 豬APOA2 基因啟動(dòng)子APOA2-4 區(qū)域缺失片段熒光活性測定

2.3 過表達(dá)GATA1 對APOA2 轉(zhuǎn)錄活性的影響

圖5 過表達(dá)GATA1 對APOA2 啟動(dòng)子活性的影響

利用在線預(yù)測軟件對-659～-565 bp 的順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5）表明，1 個(gè)潛在的GATA1 結(jié)合位點(diǎn)位于-608～-599 bp 區(qū)域。將pcDNAGATA1 真核過表達(dá)載體或pcDNA3.1（+）空載體分別與2-APOA2-1 共轉(zhuǎn)染PK-15 細(xì)胞，24 h 后雙熒光素酶活性分析表明，過表達(dá)GATA1 顯著提高了2-APOA2-1 的熒光活性（P＜0.05）。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子GATA1 結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變試驗(yàn)

對潛在的GATA1 結(jié)合位點(diǎn)序列進(jìn)行定點(diǎn)突變試 驗(yàn)（GCTTGGGAGATGATATCTACCCATGAAG），即將框中的堿基“TAT”變?yōu)椤癈CC”，構(gòu)建GATA1 結(jié)合位點(diǎn)突變載體2-APOA2-1-mut。將突變載體與野生型載體分別轉(zhuǎn)染C2C12 及PK-15 細(xì)胞，并測定雙熒光素酶活性，結(jié)果如圖6 所示。與2-APOA2-1相比，2-APOA2-1-mut 的熒光活性顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）降低，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子GATA1 結(jié)合位點(diǎn)的存在。

圖6 GATA1 結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變載體的熒光素酶活性分析

3 討論

已有研究報(bào)道，肝臟是人與鼠APOA2 蛋白的主要合成部位，小腸也可少量合成［11］。本研究利用Q-PCR 檢測了APOA2 基因在4月齡大白豬12 個(gè)組織中的表達(dá)量，表明APOA2 基因在肝臟組織中高表達(dá)，脂肪組織中次之，其他組織中低表達(dá)。

通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增獲得7 個(gè)逐級缺失的APOA2 啟動(dòng)子片段，并連接至雙熒光素酶報(bào)告載體pGL3-Basic 中，成功構(gòu)建7 個(gè)啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告載體。通過轉(zhuǎn)染C2C12、3T3-L1 及PK-15 細(xì)胞檢測雙熒光素酶活性分析各啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示，APOA2-1、APOA2-2、APOA2-3 均具有熒光活性但相對較低，APOA2-4 活性顯著上升，APOA2-5 活性降低，APOA2-6、APOA2-7 活性稍有回升，表明-813～-565 bp 為核心啟動(dòng)子區(qū)。本研究對APOA2-4 區(qū)域又進(jìn)行了5 個(gè)片段的缺失，雙熒光素酶活性結(jié)果顯示，2-APOA2-1 活性最高，約為APOA2-3 活性的5 倍，表明-659～-565 bp 區(qū)域可能存在一個(gè)或多個(gè)正向調(diào)控APOA2 基因轉(zhuǎn)錄的順式作用元件。利用生物信息學(xué)分析-659～-565 bp 區(qū)域，發(fā)現(xiàn)1 個(gè)潛在的GATA1 結(jié)合位點(diǎn)“GATGATATCT” 位于-608～-599 bp。GATA1 屬于珠蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員，包含2 個(gè)高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，通常作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA 上的特定序列“（A/T）GATA（A/G）”，從而調(diào)控基因的表達(dá)［12，13］。已有研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子GATA1 作為一個(gè)強(qiáng)增強(qiáng)子能夠促進(jìn)NBEAL2 基因的表達(dá)［14］；轉(zhuǎn)錄因子GATA1 可上調(diào)CREG 的表達(dá)進(jìn)而抑制高糖和高棕櫚酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［15］。本研究將GATA1 過表達(dá)載體pcDNA-GATA1 與APOA2 啟動(dòng)子缺失片段2-APOA2-1 共轉(zhuǎn)染，雙熒光素酶分析結(jié)果顯示APOA2 啟動(dòng)子活性顯著上升，表明GATA1正向調(diào)控豬APOA2 基因的轉(zhuǎn)錄；通過定點(diǎn)突變試驗(yàn)驗(yàn)證了GATA1 結(jié)合位點(diǎn)的存在。

4 結(jié)論

檢測了4月齡大白豬12 個(gè)組織中APOA2 基因的表達(dá)量，表明APOA2 基因主要在肝臟和脂肪組織中表達(dá)；通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析豬APOA2 基因的核心啟動(dòng)子區(qū)為-813～-565 bp；通過過表達(dá)、定點(diǎn)突變試驗(yàn)確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子GATA1 可靶向結(jié)合到APOA2 啟動(dòng)子區(qū)（-608～-599 bp），且正向調(diào)控APOA2 基因的轉(zhuǎn)錄，為深入開展APOA2 基因在豬肌內(nèi)脂肪沉積方面的功能研究奠定基礎(chǔ)。