響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌NBIN-863 的發(fā)酵工藝

劉曉艷，閔 勇，陳 偉，劉 芳，廖先清，周榮華，饒 犇

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

中國(guó)土壤正在不斷惡化，土壤病蟲(chóng)害發(fā)生種類日趨復(fù)雜，特別是作物的線蟲(chóng)病害已成為常發(fā)性寄生蟲(chóng)害，但市場(chǎng)上可供選擇的農(nóng)藥品種卻很少，作物線蟲(chóng)病的防治難度日益增加。芽孢桿菌是一類廣泛存在于土壤、湖泊、海洋、動(dòng)植物表體的生防菌，多數(shù)菌株無(wú)致病性、生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，在植物的表面易于存活、定殖、繁殖，對(duì)多種植物病害尤其是土傳病害有較好的防控效果；同時(shí)生產(chǎn)芽孢桿菌制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，制劑穩(wěn)定，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，施用方便，對(duì)人畜安全，對(duì)環(huán)境友好，是一種理想的防控線蟲(chóng)的微生物菌劑［1-5］。

在前期的研究中分離得到蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）NBIN-863 菌株，研究表明其能顯著抑制線蟲(chóng)生長(zhǎng)，具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值。通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［6-8］，可以提升該菌株的發(fā)酵水平，加快其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。本研究對(duì)NBIN-863的培養(yǎng)基配方進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)，篩選顯著的影響因子，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析，獲得最優(yōu)培養(yǎng)基組合，以期為該菌株的擴(kuò)大生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蘇云金芽孢桿菌NBIN-863 由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保藏。

1.2 供試培養(yǎng)基

①種子培養(yǎng)基。LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL；②初始發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉10 g，豆粕20 g，磷酸二氫鉀0.1 g，去離子水1 L，pH 7.5，500 mL 三角瓶裝液量為50 mL。

1.3 搖瓶培養(yǎng)

斜面菌種活化后接入LB 液體培養(yǎng)基，30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速220 r/min 條件下培養(yǎng)16 h，按2%（V/V）接種量再接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中至芽孢脫落分離20%。

1.4 芽孢數(shù)的測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液芽孢數(shù)采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。1.5 方法1.5.1 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì) 采用Minitab 的Plackett-Burman 兩水平法對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行分析，篩選影響生物量和芽孢產(chǎn)量的主要因素，確定最佳配方。

1.5.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB 試驗(yàn)得出的擬合方程，安排最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定因素，取值中心點(diǎn)。擬合方程中各變量系數(shù)確定爬坡方向和變化步長(zhǎng)，此外，步長(zhǎng)確定與試驗(yàn)條件相關(guān)。

1.5.3 中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析 根據(jù)PB 試驗(yàn)得到的因素，以最陡爬坡試驗(yàn)得到中心點(diǎn)，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)的最佳配方水平。得到描述響應(yīng)值和自變量之間關(guān)系的二階模型，即：

式中，Y 是產(chǎn)物能力測(cè)量值；b0是截距；bi是關(guān)鍵因素線性效果的系數(shù)；bii是關(guān)鍵因素二次效應(yīng)的系數(shù)；bij是關(guān)鍵因素間交互作用的系數(shù)；e 是修正系數(shù)。

根據(jù)擬合的模型以及方差分析的結(jié)果，可以評(píng)價(jià)每個(gè)因子及其交互作用對(duì)過(guò)程的影響程度，利用響應(yīng)面和等高線直觀地描繪其結(jié)果，同時(shí)利用擬合方程求解最優(yōu)的結(jié)果。

1.5.4 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證試驗(yàn) 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液的芽孢數(shù)。

1.5.5 20 L 罐發(fā)酵 用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，投料體積10 L，消泡劑0.2%，滅菌前pH 7.5，1×105Pa 滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時(shí)接入1%（V/V）的種子液，通氣比1∶0.5～1.2，罐壓0.5×105Pa，培養(yǎng)溫度30～32 ℃，攪拌常開(kāi)，發(fā)酵過(guò)程中取樣鏡檢，芽孢脫落分離20% 時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)研究結(jié)果，確定以淀粉為碳源，以豆粕、酵母膏、工業(yè)蛋白胨為氮源，共4 種因素：X1（淀粉）、X2（豆粕）、X3（酵母浸粉）、X4（工業(yè)蛋白胨）一起進(jìn)行Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)稀釋20 倍測(cè)定死亡率，設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表2 可知，淀粉和豆粕對(duì)NBIN-863 的效價(jià)有顯著影響，且兩者對(duì)芽孢形成的影響均是正效應(yīng)。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)各因素參數(shù)的t檢驗(yàn)分析結(jié)果

得到的回歸方程如下：

方程擬合的相關(guān)性為R2=0.905 7，表明此多項(xiàng)式方程很好地模擬和解釋了Plackett-Burman 的試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

找到對(duì)產(chǎn)物發(fā)酵影響最大的因素，對(duì)這些因素進(jìn)行進(jìn)一步分析。最常用的分析方法就是響應(yīng)面分析，但響應(yīng)面分析是一種局部的分析方法，是在一定范圍內(nèi)根據(jù)試驗(yàn)求得最優(yōu)解。因此，在進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)前，首先應(yīng)當(dāng)通過(guò)試驗(yàn)找到最優(yōu)值附近的區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)再進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

利用最陡上升法試驗(yàn)，以前述Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的一次方程為基礎(chǔ)，以相應(yīng)因素的系數(shù)比為基準(zhǔn)進(jìn)行步移，直到步移至最高點(diǎn)，然后以最高點(diǎn)附近的范圍作為響應(yīng)面優(yōu)化的相應(yīng)范圍。從Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到方程中淀粉和豆粕的系數(shù)（X1為9.000，X3為9.333），進(jìn)而可以得這2個(gè)因素步移的步長(zhǎng)比為0.96∶1，即當(dāng)豆粕步移1 個(gè)單位（5 g/L）時(shí)，淀粉步移0.96 個(gè)單位（4.8 g/L）。以Plackett-Burman 設(shè)計(jì)中的中心點(diǎn)（淀粉為25 g/L；豆粕為25 g/L）作為步移的起點(diǎn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3 可以看出，開(kāi)始時(shí)NBIN-863 對(duì)線蟲(chóng)的致死率隨著淀粉與豆粕的升高而增加，在步移進(jìn)行至第二步時(shí)達(dá)最高點(diǎn)，之后NBIN-863 發(fā)酵液的致死效果開(kāi)始下降。步移最高點(diǎn)時(shí)淀粉與豆粕的濃度分別為34.6 g/L 和35 g/L，這一點(diǎn)被用作下一步響應(yīng)面分析的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)及響應(yīng)面分析

由以上2 水平Plackett-Burman 試驗(yàn)可知，影響NBIN-863 致死率的2 個(gè)重要因素分別是淀粉與豆粕。根據(jù)中心優(yōu)化組合方法，設(shè)計(jì)了2 因素5 水平的響應(yīng)面分析（RSA），試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4，共13 組試驗(yàn)。

以淀粉和豆粕為自變量，以NBIN-863 對(duì)線蟲(chóng)的致死率為響應(yīng)值，根據(jù)分析結(jié)果得到的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

式中，Y 為響應(yīng)值，X1為淀粉，X2為豆粕。

利用Minitab 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，考察所擬合響應(yīng)面的形狀，結(jié)果見(jiàn)圖1 和圖2。由圖1、圖2 及軟件分析可知，該模型具有最大值，利用Minitab 軟件響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行計(jì)算可得，最大值處X1= 35.2 g/L，X2=34.7 g/L，在此條件下理論預(yù)測(cè)得到線蟲(chóng)致死率為81.2%。

表4 中心優(yōu)化組合設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖1 NBIN-863 發(fā)酵液對(duì)線蟲(chóng)致死率的等值線

圖2 NBIN-863 發(fā)酵液對(duì)線蟲(chóng)致死率的曲面分析

2.5 最佳培養(yǎng)基的驗(yàn)證

為了確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，對(duì)上述優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，共進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，測(cè)得NBIN-863 發(fā)酵液對(duì)線蟲(chóng)的致死率為83.0%，與預(yù)測(cè)值（81.2%）十分接近，比優(yōu)化前NBIN-863 的實(shí)際致死率（45.0%）提高了84%。

2.6 20 L 罐發(fā)酵

發(fā)酵周期36 h，放罐時(shí)取樣鏡檢，約20% 芽孢脫落，伴孢晶體全部形成，晶體含量為5.4 mg/mL，芽孢整齊。發(fā)酵液經(jīng)稀釋后，其對(duì)線蟲(chóng)的致死率是81.0%，較好地保持了揺瓶發(fā)酵時(shí)的活性。

3 討論

前期研究表明，影響NBIN-863 菌株活性的關(guān)鍵因素為淀粉與豆粕。通過(guò)優(yōu)化獲得NBIN-863 菌株最佳培養(yǎng)基配方為淀粉35.2 g/L、豆粕34.7 g/L、酵母浸粉4 g/L、工業(yè)蛋白胨3 g/L。在此條件下，測(cè)得NBIN-863 發(fā)酵液的晶體含量為5.4 mg/mL，稀釋后對(duì)線蟲(chóng)的致死率為81.0%，比優(yōu)化前NBIN-863的實(shí)際致死率提高了80%，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。