正源抗栓蜜丸對角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用研究

林希釩 王 振 何世勇 官睿璇 張 琳 郁萬剛

1. 大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，遼寧 大連 116044；2. 大連市中醫(yī)中科研究院，遼寧 大連 116021

腦卒中是世界范圍內(nèi)的一種高發(fā)性、高危性腦血管疾病，包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中占87%，其1年內(nèi)的致死率約10%，致殘率也高達(dá)34%[1]。中國缺血性腦卒中患者數(shù)目龐大，年輕化明顯，病死率和復(fù)發(fā)率遠(yuǎn)高于世界平均水平，是家庭和社會的沉重負(fù)擔(dān)。近年來，我國積極開展腦卒中的防治工作，不斷加大對于腦卒中臨床和基礎(chǔ)研究的投入，取得了一定成績，但國內(nèi)腦卒中防治局勢依然嚴(yán)峻，防治手段有待進(jìn)一步優(yōu)化[2-3]。

血栓指血管內(nèi)有形成分相互作用、聚集所形成的團(tuán)塊狀固體，依據(jù)其形成部位的不同可分為動脈血栓和靜脈血栓，以動脈血栓最為常見。作為中樞器官，腦參與完成機(jī)體各種生命活動，豐富的能量需求使得腦部血供系統(tǒng)復(fù)雜且脆弱，腦部血管易產(chǎn)生血栓而堵塞，導(dǎo)致周圍腦組織血供不足，引發(fā)缺血缺氧性變性及壞死，繼而影響腦的正常生理功能[2]。因此目前缺血性腦卒中的臨床治療多從血栓入手，主要采用溶栓和抗凝兩種方法，同時以支架置入術(shù)為主的介入治療也迅速發(fā)展，該病治愈率有所提高[3]。然而抗血小板治療抵抗、介入術(shù)后的再灌注損傷、抗凝藥物引起腦出血等問題依舊嚴(yán)重，探尋更為有效的治療方法成為相關(guān)醫(yī)務(wù)工作者的首要任務(wù)[4-5]。

中醫(yī)藥作為中華民族的傳統(tǒng)瑰寶，其“辨證論治”的思想對于多種疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。對于缺血性腦卒中，中醫(yī)學(xué)者從氣血運行理論出發(fā)，確立了活血化瘀為主，益氣補(bǔ)血相輔的治療理念，同時積極研發(fā)以心腦康膠囊、脈絡(luò)寧注射液為主要代表的現(xiàn)代中藥劑型，在實際臨床應(yīng)用中取得了相當(dāng)不錯的效果[6-7]，為缺血性腦卒中的治療提供了更加廣闊的思路。

本課題組長期致力于缺血性腦卒中的中醫(yī)藥療法，通過前期文獻(xiàn)調(diào)研并結(jié)合老中醫(yī)臨床經(jīng)驗確定以蝮蛇、黃芪為君藥，天麻、水蛭、丹參為臣藥；川芎、雞血藤、地龍為佐藥；麝香為使藥的關(guān)鍵復(fù)方，以中藥細(xì)粉配合蜂蜜制得便攜式蜜丸，取名正源抗栓蜜丸。其中蝮蛇、水蛭、地龍均屬蟲藥，其藥性善走，可祛風(fēng)通絡(luò)、除瘀消癥；黃芪、丹參、雞血藤活血通經(jīng)、益氣補(bǔ)虛；天麻、川芎、麝香消瘀止痛、養(yǎng)血活血。諸藥聯(lián)用，共奏活血化瘀、補(bǔ)虛通絡(luò)之效。同時現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)水蛭能夠作用于纖維蛋白原、纖溶酶原等參與血栓形成的重要分子,調(diào)節(jié)凝血級聯(lián)反應(yīng)和血小板活化[8]，從而實現(xiàn)抗血栓效應(yīng)；黃芪含有的黃芪總皂苷可增強(qiáng)前列腺環(huán)素合成酶活性，抑制血小板聚集；丹參通過抑制血栓素A2合成實現(xiàn)血小板聚集的抑制作用[9]；蝮蛇、天麻、川芎等能夠抗氧化應(yīng)激、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞以及促進(jìn)血管新生[10-12]。以上發(fā)現(xiàn)提示正源抗栓蜜丸具有良好的抗血栓和腦保護(hù)作用，能夠作為臨床治療缺血性腦卒中的潛力藥物?，F(xiàn)探究正源抗栓蜜丸對角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用，為其下一步臨床應(yīng)用提供佐證。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性KM小鼠60只，體重為(25±5)g，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動物實驗中心提供[動物使用許可證號：SYXK-(遼)2018-0007]

1.2 藥品和器械 正源抗栓蜜丸(批號：20191012，規(guī)格：0.3 g)；心腦康膠囊(吉林密之康藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z22025480)；L型角叉菜膠(上海津頌實業(yè)有限公司)；水合氯醛(上海信裕生物科技有限公司)；生理鹽水(江西科達(dá)衛(wèi)生用品公司)；一次性使用無菌注射器(大連JMS醫(yī)療器具有限公司)；游標(biāo)卡尺(日本三豐儀器)；灌胃針頭(北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 將適應(yīng)性飼養(yǎng)一周的雄性KM小鼠隨機(jī)分為六組，即空白組、模型組、心腦康膠囊組(6.0 g·kg-1)、正源抗栓蜜丸低劑量組(1.0 g·kg-1)、正源抗栓蜜丸中劑量組(2.0 g·kg-1)和正源抗栓蜜丸高劑量組(4.0 g·kg-1)，每組10只。稱重后灌胃相應(yīng)藥物和生理鹽水，灌胃體積為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)7 d。

2.2 模型制備 依據(jù)文獻(xiàn)記述[14,17-18]并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果制備小鼠尾部血栓模型。第7次灌胃后，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射L型角叉菜膠(40 mg·kg-1)并將其尾部浸入0～4 ℃冷水進(jìn)行低溫刺激，1 min后撈出并擦干。

2.3 數(shù)值測定 造模24 h后觀察小鼠行為變化并以10%水合氯醛(1 mL/300 g)進(jìn)行麻醉，然后以游標(biāo)卡尺測量小鼠尾部全長以及血栓長度，同時以組為單位拍攝小鼠尾部血栓照片。數(shù)值測定完成后處死小鼠。

3 結(jié)果

3.1 小鼠行為狀態(tài)的變化 空白組小鼠狀態(tài)如常，模型組小鼠飲食差、活動性弱、畏冷，其余各組小鼠行為狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組，以正源抗栓蜜丸中劑量組小鼠最佳。

3.2 小鼠尾部血栓 造模24 h后，各組小鼠尾部不同程度地出現(xiàn)暗紅色血栓，同時部分小鼠尾部血栓干枯脫落形成斷尾。如圖1所示。

A.模型組；B.心腦康膠囊組；C.正源抗栓蜜丸低劑量組；D.正源抗栓蜜丸中劑量組；E.正源抗栓蜜丸高劑量組圖1 小鼠尾部血栓

3.3 小鼠黑尾率、尾部血栓長度和尾部血栓相對長度的比較 與空白組小鼠相比，模型組小鼠黑尾率達(dá)100%，尾部血栓約占全尾長度的25%，差異顯著(P<0.01)，提示模型制備成功。與模型組小鼠相比，心腦康膠囊組小鼠及正源抗栓蜜丸高劑量組小鼠的黑尾率、尾部血栓長度和尾部血栓相對長度均有所降低，但差異不明顯(P>0.05)；正源抗栓蜜丸低、中劑量組小鼠的尾部血栓長度、尾部血栓相對長度以及正源抗栓蜜丸中劑量組小鼠的黑尾率降低，且差異顯著(P<0.01或P<0.05)。詳見表1。

表1 小鼠黑尾率、尾部血栓長度和尾部血栓相對長度的比較

4 結(jié)論

角叉菜膠又名卡拉膠、鹿角菜膠，屬于多糖混合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、化工等諸多領(lǐng)域，分為K型 (Kappa) 、I型 (Iota) 、L型 (Lambda)三種，能夠刺激機(jī)體釋放以IL-1β為主的多種炎性因子，損傷血管內(nèi)皮的同時激活凝血酶、活化血小板，使血小板與受損的內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附，形成血小板小梁。而受損的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的凝血因子誘發(fā)凝血級聯(lián)反應(yīng)，使得血流速度減緩，大量紅細(xì)胞吸附在血小板小梁上，從而形成血栓[13]。角叉菜膠致小鼠尾部血栓之法乃胡三覺教授等[14]自國外引入，相較于創(chuàng)傷性手術(shù)造栓，該法操作簡便、成本低廉、人為因素干擾少、尾部血栓的形成十分直觀，該方法已在抗血栓類藥物的功效研究方面得到廣泛應(yīng)用[15-16]。劉彥霞等[17]發(fā)現(xiàn)相較于皮下注射，腹腔注射能夠顯著提高小鼠尾部出栓率和出栓速度，同時劑量、溫度、濕度等因素對于小鼠尾部出栓具有一定影響；張俊林等[18]認(rèn)為同等條件下雄鼠較雌鼠更易出栓，L型角叉菜膠較I型出栓率更高且血栓相對長度更長。故本課題組以雄性KM小鼠和L型角叉菜膠作為實驗基本材料，通過腹腔注射造模，同時控制實驗溫度為(15±5)℃，濕度為20%，以保證小鼠的出栓率，為探究正源抗栓蜜丸對小鼠尾部血栓作用提供基礎(chǔ)。

小鼠尾部僅腹側(cè)一條尾動脈,左右兩側(cè)以及背側(cè)血管均為靜脈，屬于典型的單動脈供血，正常情況下血液沿尾動脈從尾根向尾梢流動，在流動過程中與周圍組織細(xì)胞不斷進(jìn)行物質(zhì)交換以保證能量供應(yīng)，然后通過三條靜脈實現(xiàn)血液回流。小鼠腹腔注射角叉菜膠后，在炎性因子的刺激下發(fā)生血管內(nèi)皮的損傷，小鼠尾梢部分在24 h內(nèi)形成暗紅色血栓并不斷向尾根部延伸，由于缺少側(cè)枝循環(huán)，血栓形成區(qū)域逐漸變性壞死并干枯脫落，形成斷尾。與小鼠尾部血栓的發(fā)展相似，缺血性腦卒中病變后期由于長期的缺血缺氧，腦組織氧化應(yīng)激明顯，并逐漸變性壞死，造成不可逆性病理損傷，使腦喪失正常生理功能，甚至于腦死亡[2,19]，同時腦部血栓的長度與缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度具有明顯的正相關(guān)性。由此可見，小鼠尾部出栓率和血栓長度的變化不但可以直接體現(xiàn)正源抗栓蜜丸的抑制血栓作用，而且在一定程度上能夠說明正源抗栓蜜丸對于缺血性腦卒中的潛在療效。因此，在該研究中我們以小鼠黑尾率、小鼠尾部血栓長度以及小鼠尾部血栓相對長度作為關(guān)鍵指標(biāo)，通過對比不同組別間上述指標(biāo)的差異以確定正源抗栓蜜丸對于角叉菜膠致小鼠尾部血栓的作用，進(jìn)而說明正源抗栓蜜丸治療缺血性腦卒中的潛能，這也與其他學(xué)者的研究相一致[12,15-16,20-21]。

實驗結(jié)果顯示，低、中劑量正源抗栓蜜丸均能顯著抑制小鼠尾部血栓形成，以中劑量效果最佳；同時高劑量正源抗栓蜜丸對小鼠尾部血栓形成的抑制作用反而不及低劑量有效，甚至與模型組無明顯差異(P>0.05)。我們認(rèn)為可能是由于高劑量組小鼠的實際藥物攝入量較低劑量組更低。例如，過高濃度藥物的攝入刺激小鼠的胃部神經(jīng)，使其反射性嘔吐，導(dǎo)致實際藥物攝入量降低。但我們在實際操作中并沒有明顯地觀察到這一現(xiàn)象。另一方面，這一反常現(xiàn)象可能與藥物自身特性有關(guān)，實驗中高劑量正源抗栓蜜丸藥物濃度可能位于倒“U”型濃度-作用曲線最適濃度的右側(cè)，與最適濃度間的距離甚至大于低劑量正源抗栓蜜丸，所以其抑制小鼠尾部血栓形成的效果不佳；再者，也可能是高濃度藥物抑制了小鼠對藥物本身的吸收或者促進(jìn)其排泄。

綜上所述，一定濃度的正源抗栓蜜丸能夠明顯降低小鼠黑尾率、尾部血栓長度以及尾部血栓相對長度，顯著抑制角叉菜膠致小鼠尾部血栓。鑒于正源抗栓蜜丸組分的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[8-12]以及角叉菜膠致小鼠尾部血栓與缺血性腦卒中發(fā)病的相似性，我們認(rèn)為正源抗栓蜜丸具有治療缺血性腦卒中的潛能，但具體療效如何，有待后續(xù)進(jìn)一步探討。