視網(wǎng)膜母細胞瘤診療的研究進展

林壯玲 綜述 張平 審校

(中山大學中山眼科中心病理科，廣州 510060)

視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)是嬰幼兒最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，占兒童惡性腫瘤的2%～4%，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)約為1/20 000～1/15 000[1‐2]，相當于全球每年新增患者約9 000例，其中我國每年新增患者約1 100例[3‐4]。約95%的病例發(fā)生于5歲前，其中約2/3發(fā)生于2歲前。單眼RB約占75%，發(fā)病年齡在2～3歲；雙眼RB多在2歲前發(fā)病[1‐2,5]。RB的發(fā)病沒有種族和性別傾向[6]。本文就RB的診療方法及其研究進展綜述如下。

1 診斷

傳統(tǒng)的RB診斷主要依靠詢問病史、眼底檢查和影像學檢查。白瞳癥和斜視是最主要的就診原因，較大年齡的患者會主訴視力下降、眼前黑朦等不適[7]。眼科檢查包括視力、眼壓、眼前節(jié)和眼底檢查，其中充分散瞳后利用雙目間接檢眼鏡進行眼底檢查是診斷RB的主要手段，檢查不合作者需在全身麻醉下進行。影像學檢查包括眼底照相、超聲、CT和MRI等。

1.1 基因診斷

近幾十年來，基因檢測技術的發(fā)展提高了我們對遺傳性疾病分子基礎的認識，其對于RB的早期診斷和治療方案的選擇具有重要意義。

1.1.1RB基因檢測技術

Sanger測序是傳統(tǒng)標準的基因突變檢測方法，對于單個基因堿基突變檢測結(jié)果可靠，但其效率低、成本高，且不能同時檢測拷貝數(shù)變異，故臨床應用受限[8]。近年來，高通量測序技術開始應用于多種疾病的篩查和診斷，比如下一代測序(next generation sequencing，NGS)可以對數(shù)百萬個DNA片段進行大規(guī)模測序，有望實現(xiàn)高效率、高敏感度并降低成本[8‐9]。此外，微陣列比較基因組雜交(array Comparative Genomic Hybridization，a CGH)、多重連接依賴性探針擴增(multiplex ligation‐dependent probe amplification，MLPA)、多重定量聚合酶鏈反應(quantitative multiplex polymerase chain reaction，QM‐PCR)可以識別RB1基因的大片段缺失和重復以及其他基因拷貝數(shù)的改變[10]。另一方面，細胞遺傳學分析技術主要包括核型分析和熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)。

1.1.2 RB 相關基因

RB在遺傳學上可分為遺傳型(占35%～45%)和非遺傳型(占55%～65%)[11]。遺傳型多表現(xiàn)為雙眼或單眼多發(fā)RB，發(fā)病年齡較早，平均就診年齡15個月，發(fā)生第二腫瘤和傳遞給后代的風險較高[3,12]。遺傳型患者中約5%可伴發(fā)顱內(nèi)腫瘤，即在雙眼發(fā)病的基礎上，松果體或蝶鞍出現(xiàn)原發(fā)腫瘤，稱為三側(cè)性RB(trilateral retinoblastoma，TRB)[13]。非遺傳型多表現(xiàn)為單眼RB，平均就診年齡較晚，約27個月，無家族史且?guī)缀鯖]有傳遞給后代的風險[3]。

Knudson[1]的“二次打擊”學說認為：RB由位于染色體13q14的RB1抑癌基因發(fā)生兩次突變導致，第1次突變發(fā)生于生殖細胞，第2次突變發(fā)生于體細胞。約93%遺傳型和87%非遺傳型RB患者存在RB1雙等位基因突變[11]。在無家族史的單眼RB患者中，只有15%患者可在血液中檢測到RB1基因突變[14]。此類患者存在“嵌合現(xiàn)象”[15]，即早期胚胎僅小部分細胞發(fā)生1個RB1基因突變，因此在外周血基因檢測中未發(fā)現(xiàn)RB1基因突變的單眼RB患者，仍需定期檢查對側(cè)眼以排除腫瘤的可能。95%雙眼RB患者的外周血可檢測到RB1基因突變，另外5%外周血基因檢測陰性患者可能是嵌合現(xiàn)象[14]。目前已知的RB1基因突變形式多樣，如終止密碼子過早出現(xiàn)、剪接位點發(fā)生點突變、啟動子甲基化等[16]。RB1基因突變引起染色體不穩(wěn)定，可導致其他腫瘤相關基因發(fā)生突變，這可能是RB患者易發(fā)生第二腫瘤的原因之一。

近年來的研究[5]顯示MYCN基因擴增及染色體突變性斷裂重組也與RB的發(fā)生有關。在部分單眼非遺傳型RB患者中，發(fā)現(xiàn)其RB1基因正常，而MYCN基因高度擴增。從RB患者基因檢測結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)染色體拷貝數(shù)改變(somatic copy number alterations，SCNAs)，比如1q，2p，6p，13q和16q等[17]。其中，染色體6p22.3上的DEK和E2F3基因及染色體1q32.1上的KIF14和MDM4基因重復突變是目前發(fā)現(xiàn)的RB最常見的伴隨基因突變[17‐18]。盡管這些染色體改變在RB發(fā)展中所起的作用尚不清楚，但有學者[17]認為RB SCNAs會影響RB1基因的表達，從而導致RB的進展。

此外，RB1基因通過調(diào)控多種關鍵的表觀遺傳過程從而促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展[18]。近年來，表觀遺傳學研究致力于發(fā)現(xiàn)潛在的診斷標志物和治療靶點，其中單鏈非編碼小分子miRNA備受矚目，其參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控，與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關。目前，通過微陣列分析、NGS等技術，已明確RB患者中與增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、化學耐受等相關的多種miRNA改變[19]。

1.1.3 房水檢測

房水檢測是近年來新開發(fā)的R B檢測方式。Berry等[20]從RB患者的房水中鑒定出腫瘤來源的無細胞DNA(cf‐DNA)，其拷貝數(shù)與眼球摘除后腫瘤組織活檢的結(jié)果一致。他們進一步檢測保眼組和眼球摘除組RB患者的房水，發(fā)現(xiàn)兩組房水的染色體6p都明顯擴增，且眼球摘除組6p的擴增量顯著高于保眼組[21]。Gerrish等[22]最近的研究證明房水中＞90%的cf‐DNA來源于腫瘤。未來房水檢測可能會對RB的診斷和治療產(chǎn)生重大影響。

1.1.4 產(chǎn)前檢測

對于有RB家族史的胎兒，在孕早期(妊娠11周)行絨毛膜取樣或在孕中期(妊娠16周)行羊膜穿刺取樣以分析胎兒DNA，潛在的流產(chǎn)風險分別為0.22%和0.11%[23]。對于明確攜帶RB突變基因的胎兒在孕早期可選擇流產(chǎn)，也可在孕36周提前生產(chǎn)以給予患兒及時治療。

2 治療

2.1 化療

2.1.1 全身靜脈化療

20世紀90年代，新一代安全有效的化療藥物使全身靜脈化療發(fā)展為RB一線治療，顯著提高了保眼率，并減少了體外放療和繼發(fā)性惡性腫瘤的發(fā)生率。目前，全身靜脈化療常作為化學減容法與局部治療聯(lián)合使用，即在IIRCC，D，E期及部分體積較大的B期腫瘤行局部治療前，先行1～3次全身化療，使腫瘤體積減小，從而減低后續(xù)局部治療的強度，以減輕并發(fā)癥并保存視功能[24‐25]。目前國際普遍使用的靜脈化療藥物有長春新堿、依托泊苷或替尼泊苷、卡鉑、環(huán)磷酰胺?；熕幬锏慕M合和療程尚未形成共識，大多數(shù)研究采用兩藥或三藥聯(lián)合使用3～6個周期的方案。Shields等[26]研究表明：使用長春新堿、依托泊苷和卡鉑行2個周期全身靜脈化療后，腫瘤直徑縮小約35%，厚度減小約50%。Beck等[27]研究表明：與聯(lián)合3種藥物行6個或更多周期治療的組相比，聯(lián)合2種藥物(依托泊苷‐卡鉑)行3個周期治療可實現(xiàn)等效的腫瘤控制。Zhu等[28]聯(lián)合3種藥物(卡鉑、依托泊苷和長春新堿)對IIRC B組眼行3個周期和6個周期治療的療效比較，結(jié)果顯示：5年隨訪中兩組的保眼率沒有差異。通常每次化療間隔時間為3～4周。臨床上常見的全身化療短期并發(fā)癥有嘔吐、脫發(fā)、貧血、中性粒細胞減少、血小板減少等，較嚴重的并發(fā)癥為依托泊苷誘發(fā)的急性淋巴細胞白血病、卡鉑導致的耳毒性等，更易發(fā)生于年齡較小且治療周期長的患兒[29‐30]。

2.1.2 動脈內(nèi)化療

近年來，動脈內(nèi)化療(intra‐arterial chemotherapy，IAC)技術取得較大進展，其對單側(cè)性RB的保眼治療具有明顯優(yōu)勢，可以明顯提高中晚期(C～E期)RB和復發(fā)性RB的保眼率，逐漸成為一線治療方法[31]。該治療方法應在血管發(fā)育成熟的患兒(年齡＞3個月且體重＞5 kg)中進行[32]，利用微導管經(jīng)頸內(nèi)動脈把化療藥物超選擇性輸送至眼動脈，使眼局部化療藥物達到最高濃度，同時顯著減少對機體其他器官組織的影響[33]，因此相較于全身靜脈化療，其全身不良反應很少，但同時也增加了晚期RB全身轉(zhuǎn)移的風險。其常用的化療藥物有美法侖、卡鉑、拓普替康，藥物組合和療程尚無共識，根據(jù)病情選擇1～3種藥物，一般行2～4次治療，每次間隔3～4周。Shields等[34]報道：對于原發(fā)性RB，ICRB B期、C期患者采用IAC治療的保眼率為100%，D期患者保眼率高達94%，E期為36%。據(jù)研究[35‐36]報道：IAC治療后復發(fā)的患者再次進行IAC治療的保眼率約為76%。IAC全身不良反應主要為骨髓抑制、中性粒細胞減少及惡心、嘔吐等胃腸道反應，多為自限性；眼部并發(fā)癥包括眼瞼水腫、眼瞼下垂、眼球運動障礙、玻璃體出血、脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮、視網(wǎng)膜血管阻塞等[37‐38]。

2.1.3 玻璃體腔內(nèi)注射化療

對于玻璃體內(nèi)播散性RB，全身靜脈化療、眼動脈介入化療及眼周化療的療效較差，而玻璃體腔注射化療因為容易引起腫瘤播散，曾被視為治療禁區(qū)。近年來，隨著對化療藥物的深入研究和玻璃體腔注射技術的改進，玻璃體腔內(nèi)注射化療已發(fā)展成為安全且有效的治療玻璃體內(nèi)播散性RB的方法，應用越來越廣泛。玻璃體腔內(nèi)注射化療最常使用的藥物是美法侖，一般推薦使用的劑量是20～30μg，據(jù)報道較低劑量(8μg)無效，而較高劑量(50μg)會導致部分患者出現(xiàn)低眼壓或眼球萎縮而導致眼球摘除[39]。Shields等[40]研究動脈內(nèi)化療聯(lián)合玻璃體腔內(nèi)注射化療治療晚期RB，結(jié)果顯示：ICRBD組保眼率從77%提高到87%，E組保眼率從25%顯著提高到73%。另一種較常使用的藥物是拓撲替康，通常在單獨用美法侖控制腫瘤失敗的情況下與美法侖聯(lián)合使用，也可單獨使用。Rao等[41]在17個病例中僅使用拓撲替康玻璃體腔內(nèi)注射，即可控制玻璃體內(nèi)播散性RB，且在中位隨訪24個月中未發(fā)現(xiàn)眼部并發(fā)癥。玻璃體注射過程中防止腫瘤播散的措施包括選擇離原發(fā)灶或播散灶較遠處作為注射點；注藥前行前房穿刺降低眼壓，從而避免玻璃體外流；在注射點的結(jié)膜下注射約2mL化療藥物；術畢在注射點進行反復冷凍和解凍循環(huán)[42‐43]。玻璃體內(nèi)注射美法侖無全身并發(fā)癥[44]，眼部并發(fā)癥少見，包括結(jié)膜下出血、輕度玻璃體出血、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫離等[45]。

2.1.4 眼周注射化療

目前臨床少用眼周注射化療，主要將其作為其他化療方式的補充方法。經(jīng)結(jié)膜下、筋膜下或球旁注射卡鉑、美法侖，能夠使玻璃體腔內(nèi)化療藥物在30 min內(nèi)達到較高濃度，據(jù)報道其濃度能達到全身靜脈化療濃度的6～10倍，并能維持數(shù)小時[46]。常見的并發(fā)癥包括眼眶脂肪萎縮、視神經(jīng)萎縮、外直肌纖維化導致眼球運動受限、斜視等[47‐48]。

2.1.5 前房注射化療

前房播散一直被視為RB的頑固表現(xiàn)，但其不具有高轉(zhuǎn)移風險，因此不宜行全身靜脈輔助化療[49‐50]。近年來參照玻璃體腔內(nèi)注射化療技術，前房注射化療已被嘗試用于治療前房播散性RB。Munier等[51]為了在所有注射眼中獲得相同的最終藥物濃度，先通過穿刺前房排空房水，再往前房中注入15～20 μg/mL美法侖，在行第二次前房注射化療后，11只眼的平均無事件隨訪時間為29個月，其中有5眼最終被摘除[52]。目前報道的最常見的并發(fā)癥是白內(nèi)障[53]。

2.2 局部治療

IIRCA期、B期RB中瘤體較小的腫瘤可單獨采用眼局部治療方法，主要包括冷凍治療、激光光凝治療、近距離放射治療、經(jīng)瞳孔溫熱療法。

2.2.1 冷凍治療

使用冷凍頭經(jīng)鞏膜對RB進行三重冷凍(溫度在-90～-80℃以下)，使腫瘤細胞內(nèi)冰晶形成和蛋白質(zhì)變性，從而導致腫瘤細胞破裂壞死[53]。冷凍療法可單獨用于治療視網(wǎng)膜赤道前部RB，打開結(jié)膜后，冷凍頭也可達到赤道后部的周邊視網(wǎng)膜[53]。據(jù)報道單純冷凍療法可成功治愈90%以上的直徑在3 mm以下的RB[54]。此外，冷凍可以破壞血‐視網(wǎng)膜屏障，有利于藥物滲透，化療前對RB行冷凍治療可提高化療效果。冷凍治療并發(fā)癥少見，包括一過性結(jié)膜水腫、短暫視網(wǎng)膜分離，體積較大或者有放療史的腫瘤經(jīng)冷凍治療后可發(fā)生玻璃體出血[55‐56]。

2.2.2 激光光凝治療

選用綠激光(波長532nm或536nm)、紅外激光(波長810nm)和遠紅外激光(波長1 064nm)破壞腫瘤血管，后兩者因穿透性更強，所以應用更為廣泛[57]。激光探頭的穿透焦點為1～2 mm，且易損傷中央凹和視盤，因此僅適合用于治療直徑≤1個視盤直徑的視網(wǎng)膜周邊部RB[53]。治療過程中功率設置在1 000～2 000 mW，能量不能過高，一是因為激光光斑會阻礙激光對深層組織的穿透，二是避免出現(xiàn)玻璃體種植、出血、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥[31]。光凝持續(xù)時間為1～2 s，直到通過間接檢眼鏡觀察到腫瘤顏色變白為止[53]。激光光凝治療的并發(fā)癥包括視網(wǎng)膜分離、血管閉塞、視網(wǎng)膜前纖維增生等[56]。

2.2.3 近距離放射治療

近距離放射治療即鞏膜外敷貼治療，采用放射性同位素碘125或釕106作為放射源，適用于直徑＜15 mm、厚度＜10 mm且無玻璃體種植或雖有局限玻璃體種植但其與腫瘤表面距離＜2 mm的ICRB B期或C期RB的治療[58]，尤其對遠離視盤和中央凹的孤立性瘤結(jié)節(jié)有較好的療效[59]。近距離放療一般不作為RB的一線治療選擇，而多用于全身化療或IAC后的輔助治療和眼內(nèi)復發(fā)RB[59]。其并發(fā)癥包括白內(nèi)障、新生血管性青光眼、玻璃體出血、放射性視網(wǎng)膜病變、黃斑病變及視神經(jīng)病變，少見持久斜視和鞏膜變薄[60]。

2.2.4 經(jīng)瞳孔溫熱療法

利用紅外線將腫瘤加熱至45～60℃來誘導腫瘤細胞毒性作用，此溫度同時能防止視網(wǎng)膜血管凝固壞死。單純熱療可成功治愈90%以上的直徑≤1.5 mm的RB[61]。另外，熱療能增強卡鉑的細胞毒性[62]。熱療的缺點是沒有溫度監(jiān)控裝置，功率設置完全憑借經(jīng)驗，治療持續(xù)時間通常為5～30 min，以腫瘤顏色變白和表面微出血為良好指標。熱療的并發(fā)癥包括虹膜萎縮伴或不伴局灶性晶狀體渾濁、視網(wǎng)膜纖維化、視網(wǎng)膜血管閉塞、孔源性視網(wǎng)膜脫離等[63‐64]。

2.3 體外放療

體外放療(external beam radiation therapy，EBRT)曾是RB一線治療方法，但因其明顯增加RB基因突變的患者發(fā)生第二惡性腫瘤的機會，且可造成眼眶發(fā)育畸形，故目前此法很少使用[65‐66]。EBRT目前主要應用于眼外期RB行眼球摘除聯(lián)合全身化療后的輔助治療，以協(xié)助控制殘余的腫瘤細胞[31]。除了可造成眼眶發(fā)育畸形，EBRT的其他主要并發(fā)癥有干眼、白內(nèi)障、青光眼及視網(wǎng)膜病變等[67]。

2.4 手術治療

2.4.1 眼球摘除術

眼球摘除術仍是目前治療晚期R B的主要手段。眼球摘除的手術指征包括單眼RB的D或E期；雙眼RB，若1只眼A期，另1只眼E期，建議摘除E期患眼；雙眼均為E期，在征得家長同意后，可行雙眼球摘除術；眼內(nèi)可疑存在活性腫瘤細胞，但由于屈光間質(zhì)渾濁無法進行眼底檢查及分期的患眼；影像學檢查顯示腫瘤可疑向視神經(jīng)蔓延，但范圍尚在球后視神經(jīng)近端的患眼[31]。眼球摘除術后應盡早植入眶內(nèi)義眼臺和義眼片，以促進眼眶發(fā)育。

2.4.2 眼眶內(nèi)容摘除術

腫瘤已穿破眼球向眶內(nèi)生長，視神經(jīng)管擴大等，應行眼眶內(nèi)容摘除術，術后聯(lián)合放射治療，但大多預后不好。此手術會影響患兒容貌，應嚴格掌握適應癥。

2.5 基因治療

RB基因治療研究方向包括向腫瘤細胞內(nèi)導入RB替代基因、抑癌基因、抗血管生成基因、自殺基因、溶瘤病毒等。有研究[68]報道，用正常的RB1基因替代腫瘤細胞中缺陷的RB1基因可以抑制腫瘤生長。野生型p53基因是經(jīng)典的抑癌基因，其突變與失活和多種癌癥的發(fā)生有關；p21基因?qū)儆诩毎芷谝揽啃约っ敢种苿┘易?，在細胞周期控制及腫瘤發(fā)生等方面具有重要作用。Audo等[69]研究顯示：將p53和p21基因分別導入RB腫瘤細胞，能成功抑制腫瘤細胞增殖并促進凋亡。向腫瘤細胞內(nèi)導入抗血管生成相關基因也是目前研究方向之一，因為新生血管不僅能為腫瘤細胞提供營養(yǎng)，還為其浸潤和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[70]，目前研究較多的是抗VEGF基因治療[71]。自殺基因治療是將能夠表達某種酶的病毒或細菌的基因?qū)肽[瘤細胞，這些酶具有將無毒或低毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性產(chǎn)物的能力，從而干擾細胞DNA合成。Chévez‐Barrios等[72]證明含單純皰疹胸苷激酶基因的重組腺病毒載體AdV‐TK聯(lián)合更昔洛韋，能在一定程度上抑制腫瘤生長，隨后的研究[73]表明修飾后的腺病毒5纖維基因具有更強的抗腫瘤活性。運用基因工程技術降低病毒毒性而形成的溶瘤病毒，可選擇性地進入腫瘤細胞中進行復制，使腫瘤細胞裂解死亡。近年來，溶瘤腺病毒VCN‐01[74]，H101[75]，Ad‐TERT p‐E1[76]在RB小鼠模型中被證明能誘導腫瘤細胞死亡。Pascual‐Pasto等[74]證明玻璃體內(nèi)注射VCN‐01與標準化療相比，可改善眼存活率，并防止腫瘤向腦內(nèi)轉(zhuǎn)移，有望為對化療耐受的患者提供靶向治療的選擇。RB基因治療有巨大的應用前景，目前仍處于摸索階段，未來將朝著靶向、精準、安全、高效的方向發(fā)展和完善。

3 結(jié)語

將傳統(tǒng)診斷模式與新興檢測技術相結(jié)合，以實現(xiàn)對RB的早期診斷和精準診斷。隨著基礎和臨床研究的進展，RB的治療已發(fā)展為以保眼率更高、并發(fā)癥更少的治療方式為主，包括動脈內(nèi)化療、玻璃體腔內(nèi)注射化療、局部治療等，同時以全身靜脈化療、體外放療、眼球摘除等為輔的治療模式。近年來前房注射化療、基因治療等新興治療方式也開始投入研究。我們堅信未來RB的診斷和治療將邁上更精準的臺階。