HPLC同時測定絳糖寧膠囊中5種活性成分的含量及聚類分析

劉源，丁廣軍，馬靈珍

1.商丘市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，河南 商丘 476100；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 亳州 236800

糖尿病是一種由胰島素分泌或利用缺陷引起的代謝性疾病。隨著人均壽命延長及老齡化社會的到來，我國糖尿病流行趨勢嚴(yán)峻，成為重要公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅到患者的身心健康［1,2］。中藥制劑以療效突出，毒副反應(yīng)小，深受廣大患者歡迎。絳糖寧膠囊具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴的功效，臨床上主要用于多飲、多尿、多食、體倦無力、脈細(xì)數(shù)無力等糖尿病患者的治療。絳糖寧膠囊由太子參、天花粉、黃芪、地黃等7味中藥組成，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國家標(biāo)準(zhǔn)WS-11448（ZD-11448）-2002-2011Z［3］，標(biāo)準(zhǔn)僅對黃芪所含黃芪甲苷進(jìn)行了定量分析。為了確保制劑的安全性、有效性，進(jìn)一步全面科學(xué)地評價產(chǎn)品質(zhì)量，多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式近年來已廣泛應(yīng)用于其質(zhì)量控制中。本實驗采用HPLC梯度洗脫法對絳糖寧膠囊中君藥黃芪所含活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮，臣藥天花粉所含特征成分葫蘆素B以及佐藥太子參所含太子參環(huán)肽B5種成分同時進(jìn)行含量測定，建立絳糖寧膠囊多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，并采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對所測含量進(jìn)行聚類分析，為全面評價和提升絳糖寧膠囊整體質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司）。葫蘆素B對照品（批號：111945-201301，含量：96.9%，CAS號6199-67-3）和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：111920-201907，含量：96.8%，CAS號20633-67-4）來源于中國食品藥品檢定研究院；太子參環(huán)肽B對照品（批號：18031328，含 量：99.9%，CAS號145459-19-4）、芒柄花苷對照品（批號：17081841，含量：98.1%，CAS號486-62-4）和毛蕊異黃酮對照品（批號：17050931，含量：99.6%，CAS號20575-57-9）來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純；絳糖寧膠囊（生產(chǎn)企業(yè)：貴州聯(lián)盛藥業(yè)有限公司；批號：190204、190207、190211、190302、190901、190903、200105、200109、200201、200204，編號分別為S1～S10；批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z20 044486；規(guī)格：每粒裝0.4 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備精密稱取太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮對照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.232、0.128、1.756、1.054和0.718 mg/mL的混合對照品貯備液。精密吸取混合對照品貯備液0.10、0.20、0.50、1.00、1.50和2.00 mL，分別置于6個20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成6個系列質(zhì)量濃度線性考察混對溶液Ⅰ～Ⅵ；取線性考察混對溶液Ⅳ作為混合對照品溶液（太子參環(huán)肽B 11.6 μg/mL、葫蘆素B 6.4 μg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷87.8 μg/mL、芒柄花苷52.7 μg/mL和毛蕊異黃酮35.9 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備取絳糖寧膠囊內(nèi)容物研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，加熱回流提取45 min，放冷后用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得絳糖寧膠囊供試品溶液。按絳糖寧膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的處方工藝，分別制備不含太子參、不含天花粉和不含黃芪的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

采用Diamasil C18液相色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～14.0 min，36.0%A；14.0～21.0 min，36.0%→48.0%A；21.0～28.0 min，48.0%→52.0%A；28.0～43.0 min，52.0%→64.0%A；43.0～50.0 min，64.0%→36.0%A），流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：203 nm（0～21.0 min檢測太子參環(huán)肽B）［4-6］、227 nm（21.0～28.0 min檢測葫蘆素B）［7-9］和254 nm（28.0～50.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮）［10-12］，理論板數(shù)按各目標(biāo)化合物色譜峰計均不得低于3 000。精密吸取2.1.1項下混合對照品溶液及2.1.2項下溶液各10 μL，進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果供試品色譜圖中太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮色譜峰峰形好，分離度均≥1.5，陰性樣品對絳糖寧膠囊中太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的測定無干擾，色譜圖見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.1”項下6個系列質(zhì)量濃度線性考察混對溶液適量，依次進(jìn)樣測定絳糖寧膠囊中5種成分的峰面積，以太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得5種成分的回歸方程、線性范圍及r值見表1。

表1 5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4 精密度考察

取“2.1.1”項下混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的峰面積，計算5種成分峰面積的RSD分別為0.89%、1.10%、0.56%、0.71%和0.82%。

2.5 重復(fù)性考察

取絳糖寧膠囊樣品，按“2.1.2”項下方法配制6份絳糖寧膠囊供試品溶液，依法進(jìn)樣分析，記錄太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的峰面積并計算各目標(biāo)化合物的含量，結(jié)果5種成分含量的RSD分別為1.64%、1.89%、1.16%、1.28%和1.55%。

2.6 穩(wěn)定性考察

臨用新配制一份絳糖寧膠囊供試品溶液，于配制后0、2、6、12、18和24 h進(jìn)樣檢測太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的峰面積，結(jié)果5種成分峰面積的RSD分別為0.91%、1.07%、0.52%、0.66%和0.75%，表明絳糖寧膠囊供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

取5種目標(biāo)化合物含量均已知的同一批次絳糖寧膠囊內(nèi)容物，研細(xì)后，取9份，每份約1.0 g，精密稱定，隨機3份分為1組，依據(jù)《中國藥典》2015年版四部規(guī)定，分別精密加入混合對照品溶液（太子參環(huán)肽B 0.057 mg/mL、葫蘆素B 0.036 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.489 mg/mL、芒柄花苷0.271 mg/mL、毛蕊異黃酮0.193 mg/mL）1.0 mL，2.0 mL和3.0 mL各1組，使對照品加入量約為樣品原有量的50%，100%和150%，再按“2.1.2”項下方法制成加樣回收樣品溶液，依法進(jìn)樣測定太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的峰面積，計算目標(biāo)化合物含量，用測得量與樣品原有量之差除以對照品加入量計算5種成分的回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2 絳糖寧膠囊中5種成分的加樣回收率

（續(xù)表）

2.8 樣品含量測定

取10個批次的絳糖寧膠囊樣品，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液（每批樣品平行制備3份），依法進(jìn)樣檢測太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的峰面積，計算5種成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 10批絳糖寧膠囊樣品的含量（n=3） mg/g

2.9 聚類分析

為考察不同批次絳糖寧膠囊中5種成分太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的含量差異，利用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，以表3中各目標(biāo)化合物的含量測定結(jié)果為變量，對10個批次的絳糖寧膠囊樣品進(jìn)行聚類分析（聚類方法設(shè)定為組間聯(lián)接，測量區(qū)間設(shè)定為歐氏距離），結(jié)果見圖2。由圖可知，當(dāng)類間距離為10時，10批樣品聚為3類，樣品S8、S10、S9和S7聚為第Ⅰ類，樣品S1、S3、S2和S4聚為第Ⅱ類，樣品S5和S6聚為第Ⅲ類；當(dāng)類間距離為20時，10批樣品聚為2類，第Ⅰ類和第Ⅱ類合并為一類，第Ⅲ類為一類。從分類結(jié)果可以看出，目標(biāo)化合物含量差異與絳糖寧膠囊樣品批次期間有關(guān)，可能與制劑生產(chǎn)所用原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素引起的批間質(zhì)量差異有關(guān)。

3 討論

3.1 流動相的選擇

本實驗首先對流動相進(jìn)行了優(yōu)化選擇，分別對比考察了乙腈-水［4-6］、甲醇-水［7,8］、乙腈-0.1%冰醋酸溶液［9］、乙腈-0.1%甲酸溶液［10,11］和乙腈-0.1%磷酸溶液［12］5個流動相體系。結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫檢測時，色譜圖基線平穩(wěn)，5種成分太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮色譜峰峰形對稱，分離度較好，雜質(zhì)干擾小，同時對流動相梯度洗脫比例進(jìn)行了摸索，最終確定采用“2.2”項下的色譜條件檢測絳糖寧膠囊中太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮的含量。

3.2 供試品提取方式的選擇

在絳糖寧膠囊樣品處理時，本實驗參考相關(guān)文獻(xiàn)以甲醇［4-6,9-12］為溶劑，分別比較超聲提取［4-13］、加熱回流提?。?2］兩種提取方式對太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮綜合提取率的影響，結(jié)果加熱回流提取優(yōu)于超聲提取，遂對提取時間（30、45、60 min）進(jìn)行不斷摸索，最終確定采用甲醇加熱回流45 min為絳糖寧膠囊供試品提取方法。

本實驗采用HPLC法對絳糖寧膠囊中太子參環(huán)肽B、葫蘆素B、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和毛蕊異黃酮5種成分含量進(jìn)行同時測定，建立了絳糖寧膠囊多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制模式，從表3中各目標(biāo)化合物含量測定結(jié)果來看，所測各成分具有一定的批間差異，表明本實驗所建立的方法對絳糖寧膠囊的質(zhì)量控制具有重要意義。同時通過SPSS 26.0統(tǒng)計軟件中聚類分析等化學(xué)計量學(xué)手段對10個批次絳糖寧膠囊樣品中5種化合物質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，結(jié)果表明目標(biāo)化合物含量差異與絳糖寧膠囊樣品批次期間有關(guān)，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)加強原藥材來源質(zhì)量控制和制劑生產(chǎn)過程參數(shù)控制。本實驗所建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于絳糖寧膠囊的質(zhì)量控制，為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了有力的實驗數(shù)據(jù)。