植物病原真菌效應(yīng)蛋白研究進(jìn)展

王梧嵋

（西藏大學(xué) 理學(xué)院，西藏自治區(qū) 拉薩 850000）

細(xì)菌、真菌、病毒等微生物都能引起植物病害，但真菌引起的病害最為普遍，造成的損失也最嚴(yán)重。大致來說，植物寄生真菌的數(shù)量多于其他所有寄生體的總和[1]?；铙w營養(yǎng)的寄生真菌往往高度?；?，它們可以通過特異性的效應(yīng)蛋白改變寄主的生理和防御狀態(tài)，促進(jìn)自身的存活與繁殖。這些效應(yīng)蛋白依據(jù)被分泌和發(fā)揮作用的位點(diǎn)大致被分為兩類：細(xì)胞間效應(yīng)蛋白和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)蛋白。前者發(fā)揮胞壁降解酶和部分蛋白酶抑制劑的作用，后者可抑制細(xì)胞內(nèi)免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵靶標(biāo)或被識(shí)別而激發(fā)過敏性壞死反應(yīng)。

Flor 等提出的“基因?qū)蚣僬f”[2]：為了破壞由病原特征分子（Pathogen-Associated Molecular Patterns， PAMPs）啟動(dòng)的植物基礎(chǔ)防御反應(yīng)PTI（PAMP-Triggered Immunity），病原菌將分泌一類具有特異性的毒性效應(yīng)蛋白（effectors）；而植物隨之在進(jìn)化過程中產(chǎn)生一類抗性基因（R gene），編碼出抗性蛋白（R protein）并特異性地識(shí)別效應(yīng)蛋白，此時(shí)效應(yīng)蛋白發(fā)揮無毒性功能（Avirulence，Avr），將激發(fā)植物下游更為激烈的免疫反應(yīng)ETI（Effector-Triggered Immunity）。植物和病原菌在長期協(xié)同進(jìn)化過程中[3]，不斷發(fā)生效應(yīng)蛋白發(fā)揮毒性破壞植物防御反應(yīng)和效應(yīng)蛋白被特異性識(shí)別激發(fā)免疫反應(yīng)的過程，形成“Z”字拉鋸[4]。

1 真菌效應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)

目前所知的真菌效應(yīng)基因在結(jié)構(gòu)上并沒有太明顯的統(tǒng)一特征。從大麥云紋病菌中克隆得到的NIP1 效應(yīng)蛋白富含半胱氨酸殘基，從尖孢鐮刀菌中克隆得到的SIX1（Secreted In Xylem 1）效應(yīng)蛋白也具有這一特征。番茄葉霉菌的效應(yīng)基因Avr2、Avr4、Avr4E 和Avr9，稻瘟菌的效應(yīng)基因AvrPita、Pwl，它們所編碼的效應(yīng)蛋白除富含半胱氨酸外都是小分子的分泌蛋白[5]。自亞麻銹菌中克隆得到第一個(gè)銹菌基因Avr567 以來，目前已有30 多個(gè)效應(yīng)基因被獲得。它們?nèi)珵榉置诘鞍祝腋缓腚装彼?，都能在植物抗性基因識(shí)別下激發(fā)植物抗病反應(yīng)。而一些真菌效應(yīng)蛋白并不具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，表明可能存在其它未知的蛋白分泌途徑[6]。

2 真菌效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)

免疫熒光標(biāo)記顯示，蠶豆銹菌侵染寄主葉片后，分泌的效應(yīng)蛋白R(shí)TP1 將在吸器周圍富集。亞麻銹菌無毒基因AvrM和AvrL567 在煙草細(xì)胞中過表達(dá)后，其編碼的效應(yīng)蛋白將通過煙草細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的分泌系統(tǒng)分泌到細(xì)胞外[7]。對(duì)真菌而言，其效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，既不同于細(xì)菌借由多種分泌系統(tǒng)，也不同于卵菌借由膜上磷脂分子完成；由于效應(yīng)蛋白的多樣性，它們可能采用多種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入植物寄主體內(nèi)。

3 真菌效應(yīng)蛋白作用機(jī)制

病原菌分泌的效應(yīng)蛋白進(jìn)入寄主細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)部后，通過不同的方式來破壞寄主植物的防御反應(yīng)，這是已發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)蛋白的一般共性，而大部分效應(yīng)蛋白具體的作用機(jī)制仍不清楚。

3.1 特異性結(jié)合抑制免疫反應(yīng)的激發(fā)

番茄葉霉菌通過釋放效應(yīng)蛋白Ecp6，在寄主植物中生長的同時(shí)抑制由寄主細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的PTI 反應(yīng)[8]。Ecp6 蛋白含有LysM 域，通過選擇性地與幾丁質(zhì)寡糖結(jié)合，阻止后者被寄主表面受體識(shí)別，從而抑制PTI 的激發(fā)。神奇的是，稻瘟病菌的分泌蛋白Slp1 也含有LysM 域，它可以發(fā)揮與番茄葉霉菌中效應(yīng)蛋白類似的功能。Slp1 蛋白通過競(jìng)爭(zhēng)性地與自身細(xì)胞壁被降解所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)寡糖結(jié)合，阻礙水稻中的幾丁質(zhì)激發(fā)子結(jié)合蛋白CEBiP 識(shí)別這些幾丁質(zhì)寡糖，從而抑制由幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的下游免疫反應(yīng)。

大豆疫霉菌效應(yīng)蛋白PsAvh262 可以通過結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)免疫球蛋白BiPs 來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的細(xì)胞程序性死亡，負(fù)調(diào)控植物對(duì)大豆疫霉的抗病反應(yīng)[9]。大豆疫霉菌分泌的效應(yīng)蛋白PsXEG1 毒性很強(qiáng)，在進(jìn)化過程中大豆植株產(chǎn)生了一種葡聚糖酶抑制蛋白GmGIP1，其與PsXEG1 結(jié)合從而影響其毒力。但最近的研究發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉菌開始分泌一種無酶活性的旁系同位素PsXEG1 樣蛋白PsXLP1，它更緊密地結(jié)合GmGIP1 而有利于PsXEG1 的釋放，以實(shí)現(xiàn)病原菌的侵染[10]。

3.2 作為寄主酶類抑制劑發(fā)揮作用

番茄葉霉菌效應(yīng)蛋白Avr2 能特異性地結(jié)合并抑制寄主植物所分泌的Rcr3、Pip1、TDI-65 等胞外酶，從而減弱植株的PTI 抗病反應(yīng)[11]。玉米的過氧化物酶POX12 可以控制植株活性氧的產(chǎn)生，激發(fā)并調(diào)控植株激烈的抗病反應(yīng)；而玉米瘤黑粉菌所產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白Pep1 通過在胞外與該過氧化物酶結(jié)合并抑制其活性，破壞下游信號(hào)傳導(dǎo)。

3.3 調(diào)節(jié)寄主的代謝、基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄

玉米瘤黑粉效應(yīng)蛋白Cmu1 是一個(gè)分支酸變位酶，進(jìn)入植物細(xì)胞后，Cmu1 蛋白可以促使莽草酸酯合成途徑中的代謝路徑由合成水楊酸轉(zhuǎn)變成合成芳香族氨基酸，使得水楊酸含量降低。而水楊酸是植物防御反應(yīng)中重要的植物激素成員之一，其含量直接影響植物的免疫反應(yīng)；因此，Cmu1 可以通過調(diào)節(jié)寄主細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑來抑制寄主的防御反應(yīng)。

由大豆疫霉菌產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白PsAvh23，在轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入寄主細(xì)胞質(zhì)后，通過結(jié)合寄主的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HAT 復(fù)合物操縱植物的組蛋白乙?；^程，進(jìn)而重編程防御基因的表達(dá)以促進(jìn)自身感染[12]。大麥白粉菌的效應(yīng)蛋白Avra10 可以被大麥的抗性蛋白MLa10 特異性識(shí)別，而研究證明MLa10 定位于植物細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)，這說明效應(yīng)蛋白Avra10 可以作為轉(zhuǎn)錄因子直接進(jìn)入寄主細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生互作，調(diào)節(jié)抗病基因MLa10 的表達(dá)[13]。大麗輪枝菌分泌的效應(yīng)蛋白VdSCP 41進(jìn)入植物細(xì)胞核后，將直接靶向植物的重要免疫調(diào)控因子CBP60g 和SARD1，干擾其轉(zhuǎn)錄活性從而抑制相關(guān)免疫基因的表達(dá)[14]。

4 植物真菌效應(yīng)蛋白功能研究方法

4.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、圖位克隆獲得效應(yīng)基因

在獲得病原菌基因組序列的基礎(chǔ)上，可以利用生物信息分析軟件（如Blast，SignalP，TargetP，TMHMM，和big-PI Predictor 等）對(duì)該病原菌的效應(yīng)蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)。

在 稻 瘟 菌 所 得 的 效 應(yīng) 基 因 中，Pwl1、Pwl2、AvrPiz-t、Avr-Pita 和Avr1-CO39 是通過圖位克隆得到的，還有油菜莖基潰瘍病菌基因組異染色質(zhì)的效應(yīng)基因Avr Lm1 也是經(jīng)圖位克隆獲得的[15]。Yoshida 等將基因組信息與遺傳學(xué)結(jié)合起來進(jìn)行分析，找到了3 個(gè)新的稻瘟病菌無毒基因[16]。

4.2 異源表達(dá)分析效應(yīng)蛋白功能

4.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)，具有時(shí)耗短、表達(dá)高，且涉及的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)將不會(huì)在實(shí)驗(yàn)外對(duì)環(huán)境造成污染危害的優(yōu)點(diǎn)[17]。在目的基因與CaMV 35S 啟動(dòng)子的共表達(dá)下，利用農(nóng)桿菌注射植物葉片，可以在單一葉片中快速、簡(jiǎn)便地同時(shí)高表達(dá)多個(gè)重組載體[18]，這可以用于效應(yīng)蛋白毒性及功能的初步鑒定。Chen 等結(jié)合農(nóng)桿菌注射本氏煙葉片的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)和水稻原生質(zhì)體制備方法，對(duì)5 個(gè)誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死的新無毒性效應(yīng)蛋白進(jìn)行了鑒定[19]。

4.2.2 寄主植株中穩(wěn)定表達(dá)方法

通過構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株，可以實(shí)現(xiàn)植物中效應(yīng)蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。雖然在這項(xiàng)工作中，前期制備穩(wěn)轉(zhuǎn)植株所需周期較長，但這些植株將有利于獲得大量的功能性分析結(jié)果，并為后續(xù)研究提供獨(dú)特、合理的方法[20]。

4.2.3 酵母系統(tǒng)異源表達(dá)方法

研究發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和抑制細(xì)胞死亡這樣的“雙重”性是種間保守的，且在酵母表達(dá)中保持一致，如在酵母中表達(dá)效應(yīng)蛋白AvrPtoB，它能夠抑制被誘發(fā)的程序性細(xì)胞死亡[21]。Cesari 等利用酵母雙雜交技術(shù)研究稻瘟菌無毒效應(yīng)蛋白AVR1-CO39 與水稻中RGA4、RGA5 基因的互作，證實(shí)了水稻中的這兩個(gè)基因是特異性識(shí)別所必需的。單衛(wèi)星課題組利用酵母雙雜交技術(shù)及其后的共聚焦顯微鏡亞細(xì)胞定位，鑒定了辣椒疫霉菌效應(yīng)蛋白Pc Avr3a12 與寄主的靶標(biāo)脯氨酰順反異構(gòu)酶（PPIase）FKBP15-2 發(fā)生免疫性互作[22]。

4.3 結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析

通過分析效應(yīng)蛋白AvrPtoB 的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其C 端對(duì)植物的細(xì)胞程序性壞死的抑制作用不依賴于N 端，而對(duì)效應(yīng)蛋白AvrPto 進(jìn)行核磁共振結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，它可能和Pto 發(fā)生相互作用而不受蛋白酶限制。

5 結(jié)語

真菌效應(yīng)蛋白的高度多樣性和與其他蛋白的低相似性，使得對(duì)這一病原特征物的研究難度加大[23]。鑒于目前所面對(duì)的是大量候選的、未知的效應(yīng)蛋白，這將是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的巨大工程[24]。而另一方面，對(duì)真菌效應(yīng)蛋白的研究將有望揭示病原真菌營養(yǎng)方式和植物與病原真菌共同進(jìn)化的分子機(jī)制，這可能將給植物疾病控制帶來創(chuàng)新[25]。目前，國際上公認(rèn)的最經(jīng)濟(jì)有效的作物病害防控措施是種植抗病品種，而具有識(shí)別無毒性效應(yīng)蛋白功能的植物抗性基因便是其中的重要成員。

基因組研究、生物信息學(xué)分析、蛋白質(zhì)定位和更多技術(shù)的快速發(fā)展，將為探索真菌效應(yīng)蛋白在植病互作中所發(fā)揮的作用提供強(qiáng)大助力。