清腎丸的微生物限度檢查及影響因素分析

易偉 李思 吳晶晶 蘇華 龔光明

[摘要] 目的 建立清腎丸微生物限度檢查法，并對其微生物檢查結(jié)果進行分析，為實際生產(chǎn)提供參考。 方法 參照2015年版《中國藥典》中的方法，建立清腎丸和清腎丸中8種中藥飲片的微生物計數(shù)方法。對30批次清腎丸進行微生物限度檢查，考察其需氧菌含量與丸劑水分的關(guān)系，并考察其微生物含量與烤丸時間的關(guān)系，并對清腎丸中8種中藥飲片的微生物含量進行分析。 結(jié)果 清腎丸的微生物污染菌主要是需氧菌。清腎丸水分越高，其微生物污染水平越高;烤丸時間越長，丸劑水分逐漸減少，需氧菌總數(shù)也逐漸減少。8種中藥飲片中蒲公英的微生物污染最嚴重。 結(jié)論 應嚴格控制清腎丸水分和烤丸時間，并建立中藥飲片微生物限度標準，以引導實際生產(chǎn)，逐步提高清腎丸質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 清腎丸;微生物限度檢查;質(zhì)量分析;中藥飲片

[中圖分類號] R927? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）10（c）-0138-04

Microbial limit test and influence factor analysis of Qingshen Pills

YI Wei? ?LI Si? ?WU Jingjing? ?SU Hua? ?GONG Guangming

Department of Pharmacy， General Hospital of the Chinese People′s Liberation Army Eastern Zone， Jiangsu Province， Nanjing? ?210002， China

[Abstract] Objective To establish the microbial limit test method for Qingshen Pills， and analyze the results of the microbiological tests， and provide reference for actual production. Methods With reference to the method in the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia， a method for microbial counting of 8 kinds of traditional Chinese medicine in Qingshen Pills and Qingshen Pills was established. The microbial limit tests of 30 batches of Qingshen Pills were tested to investigate the correlation between the content of aerobic bacteria and the moisture of the pill， and the correlation between the microbial content and the baking time. And the microbiological contents of 8 kinds of traditional Chinese medicine in Qingshen Pills were analyzed. Results The microbial contamination of Qingshen Pills is mainly aerobic bacteria. The higher the water content of Qingshen Pills was， the higher the microbial contamination level was. The longer the baking time， the less the moisture of the pills and the less the total number of aerobic bacteria. Dandelion had the most serious microbial contamination in 8 kinds of traditional Chinese medicine. Conclusion The water content and baking time of Qingshen Pills should be strictly controlled， and microbial limit standards for traditional Chinese medicine should be established to guide actual production and gradually improve the quality of Qingshen Pills.

[Key words] Qingshen Pills; Microbial limit test; Quality analysis; Traditional Chinese medicine

醫(yī)院制劑中，口服中藥制劑是最常見的劑型，具有使用方便、療效好、制備工藝簡單等特點。相關(guān)文獻顯示[1-2]，醫(yī)院口服中藥制劑微生物限度檢查合格率相對較低。這可能是由于其生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)多、周期長，各個環(huán)節(jié)都有可能導致微生物污染，特別是工藝及條件設(shè)計不合理更容易污染制劑[3]。此外，中藥口服制劑的原料，即中藥材，是微生物污染的重要途徑，藥材的前處理對制劑的衛(wèi)生質(zhì)量有很大影響[4-5]。對于直接以藥材原粉入藥的制劑，檢查藥材前、處理后的微生物含量并根據(jù)其藥性進行除菌操作（微波滅菌、輻射滅菌、酒精噴灑、流通蒸汽、高溫烘干、環(huán)氧乙烷滅菌）[6-8]，有利于提高成品微生物限度檢查合格率。

清腎丸為東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科（以下簡稱“我科”）自制制劑，由金銀花、丹參等10味中藥組成，具有活血化瘀、涼血止血之功效。清腎丸的制備工藝中大多以藥材原粉入藥，因此，為提高成品微生物限度檢查合格率，保障用藥安全，本研究通過對30批次清腎丸進行微生物限度檢查，考察其微生物含量的影響因素，希望為清腎丸的實際生產(chǎn)和微生物質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PYX-DHS.500-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）;PYX-DHS-40×50隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）;MJ-160霉菌培養(yǎng)箱（上海恒科有限公司）;SQ510C高壓蒸汽滅菌器（雅馬拓科技貿(mào)易有限公司）;蘇Q/WS2-175-79電熱恒溫鼓風干燥箱（連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）;CT-C-II熱風循環(huán)烘箱（連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）;MP1100B、MP2001電子天平（上海恒平科學儀器有限公司，精密度：0.01 g）;HTY-761勻漿儀（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）;XW-80A渦旋儀（上海馳唐電子有限公司）;MA35水分儀（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 試藥

清腎丸：30批次均由我科提供。中藥飲片：金銀花、丹參、紅花、當歸、赤芍、板蘭根、川芎、蒲公英8種中藥飲片均購自南京鶴齡藥事服務有限公司。

1.3 定量菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003第4代，規(guī)格：（1.0～2.0）×106/支];銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104第4代，規(guī)格：（1.0～2.0）×106/支];枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501第4代，規(guī)格：（1.0～2.0）×106/支];大腸埃希菌[CMCC（B）44102第4代，規(guī)格：（1.0～2.0）×106/支];乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094第4代，規(guī)格：（1.0～2.0）×106/支];白色念珠菌[CMCC（F）98001第4代，規(guī)格：（1.0～2.0）×106/支];黑曲霉[CMCC（F）98003第4代，規(guī)格：（1.0～2.0）×106/支]。以上菌株均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：190321）;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：190307）;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：181126）;麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：1905212）;麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號：1701122）;腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號：181226）;紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：1906062）;RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號：181220）;木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（批號：1905282）。上述培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司，培養(yǎng)基適用性檢查均符合2015年版《中國藥典》第四部[9]通則的要求。

稀釋劑：pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依照2015年版《中國藥典》第四部[9]微生物限度檢查項下稀釋劑配制方法配制，滅菌備用。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對于平板計數(shù)結(jié)果數(shù)值均以對數(shù)值，即Lg值表示，Lg值為0.5表示菌落數(shù)（N）<10 cfu/g;對于耐膽鹽革蘭陰性菌，Lg值為0.5表示N<10 cfu/g，1.5代表10 cfu/g

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的稀釋

取4代定量菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌各1支，放置室溫。分別吸取菌株復溶液1 mL，混勻。用稀釋劑制成適宜濃度的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備

取樣10 g，加稀釋劑至100 mL，用勻漿儀研勻，制成1∶10供試液，備用。

2.3 方法適用性試驗

參照2015年版《中國藥典》第四部[9]通則1100生物檢查法，對清腎丸進行方法適用性試驗，確定其微生物限度檢查方法為：需氧菌、霉菌及酵母菌計數(shù)采用1∶10供試液，計數(shù)方法為1 mL/皿。大腸埃希菌檢查：取1∶10供試液10 mL至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照《中國藥典》第四部[9]中大腸埃希菌檢查法檢查。耐膽鹽革蘭陰性菌檢查采用定量檢查法：取10 g樣品用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制成1∶10供試液，取相當于0.100、0.010、0.001 g樣品至10 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照《中國藥典》第四部[9]中耐膽鹽革蘭陰性菌檢查法檢查。沙門菌檢查方法：取樣品10 g至200 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按照《中國藥典》第四部[9]中沙門菌檢查法檢查。其微生物限度標準，均參照2015版《中國藥典》第四部[9]實施。對8種中藥飲片進行微生物計數(shù)方法的適用性試驗，其需氧菌、霉菌及酵母菌檢查采用1∶100供試液，計數(shù)方法為1 mL/皿。

2.4 30批次清腎丸微生物檢驗結(jié)果分析

本次共完成30批次清腎丸的微生物限度檢查，需氧菌總數(shù)：<102 cfu/g的樣品占3.33%，102～103 cfu/g的樣品占10.00%，103～104 cfu/g的樣品占70.00%，104～6×104 cfu/g的樣品占13.33%，>6×104 cfu/g的樣品占3.33%。霉菌及酵母菌總數(shù)：所有批次均<102 cfu/g?？刂凭核信文湍扄}革蘭陰性菌均<10 cfu/g;大腸埃希菌均未檢出（1 g）;沙門菌均未檢出（10 g）。檢驗結(jié)果顯示，清腎丸中主要是需氧菌污染，需氧菌總數(shù)<104 cfu/g的樣品占總數(shù)的83.33%，遠小于6×104 cfu/g，結(jié)果較為滿意，但仍有3.33%超出限度范圍。

2.5 清腎丸需氧菌含量與丸劑水分的相關(guān)性

清腎丸水分測定方法為：將樣品粉碎均勻，取約5 g于樣品碟中，盡量鋪平，采用水分儀進行測定。其標準為不得過9.0%。對10批次清腎丸進行需氧菌含量與水分的測定，發(fā)現(xiàn)清腎丸水分越高，其微生物污染水平越高。見圖1。

2.6 清腎丸微生物含量與烤丸時間的相關(guān)性

清腎丸的烤丸工藝采用熱風循環(huán)烘箱，緩慢升溫至105℃。本研究于0、1、2、3、4、5、6 h取樣，分別測定需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)、耐膽鹽革蘭陰性菌總數(shù)和水分。實驗發(fā)現(xiàn)控制菌大腸埃希菌在2 h被殺滅，沙門菌在3 h被殺滅;隨著烤丸時間的增加，丸劑水分逐漸減少，需氧菌總數(shù)也逐漸減少。霉菌及酵母菌總數(shù)以及耐膽鹽革蘭陰性菌總數(shù)在3 h后數(shù)值降至0.5，即含量<10 cfu/g。見圖2。

2.7 清腎丸中8種中藥飲片樣品的微生物檢查結(jié)果

對清腎丸中8種中藥飲片進行微生物限度檢查，其微生物檢查結(jié)果見表1。本研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英的需氧菌總數(shù)和霉菌、酵母菌總數(shù)都比較高，微生物污染最嚴重;赤芍和川芎的需氧菌含量較低;當歸、丹參的霉菌及酵母菌含量較低。見圖3～4。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，清腎丸的微生物污染主要是需氧菌。清腎丸水分越高，其微生物污染水平越高;烤丸時間越長，丸劑水分逐漸減少，需氧菌總數(shù)也逐漸減少。而丸劑水分的高低與烤丸溫度、烤丸時間是密不可分的，實驗顯示溫度為105℃，烤丸時間為6 h，這樣既保證了樣品中微生物的控制水平，也保證了樣品水分。實驗中考察了提高烤丸溫度、增加烤丸時間，發(fā)現(xiàn)溫度增加會使丸劑烤焦，烤丸時間為7、8 h，丸劑會崩解，不符合規(guī)定。

從30批次的樣品統(tǒng)計結(jié)果可以看出，3.33%的樣品超出微生物限度范圍。因此本研究考察了中藥飲片的微生物負載量。根據(jù)樣品來源部位，可以將8種飲片進行分類。當歸、赤芍、板藍根和川芎歸為根類，金銀花和紅花歸為花類，蒲公英是全草入藥。從實驗結(jié)果可以看出根類飲片的微生物含量偏低，相關(guān)文獻研究發(fā)現(xiàn)全草類、花類中藥飲片微生物負載較高，根類中藥飲片的微生物負載相對較低[10-13]?；愶嬈薪疸y花的微生物負載相對較低，這可能與金銀花的抑菌性有關(guān)[14-16]。因此為控制清腎丸微生物質(zhì)量，需嚴格控制其原料中藥飲片的微生物量。但是由于中藥制劑原料的特殊性，也由于缺乏權(quán)威、統(tǒng)一的質(zhì)量標準以及有效的滅菌方法，我國中藥飲片微生物負載量整體較高，不同類型飲片間微生物污染差異較大[17-23]。2015年版《中國藥典》第四部[9]僅規(guī)定了直接口服或泡服中藥飲片的耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌的限度標準，其他類型飲片未作規(guī)定。因此，我國中藥飲片的微生物限度標準亟待完善。為提高清腎丸微生物質(zhì)量，可以構(gòu)建我科中藥飲片的微生物限度標準作為內(nèi)控標準，指導安全生產(chǎn)，保障患者用藥安全。

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（收稿日期：2020-06-04）

[基金項目] 國家自然科學基金資助項目（31671026）;全軍醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高科研專項課題重點項目（14ZJZ08）。

[作者簡介] 易偉（1989-），女，碩士;研究方向：微生物檢驗、醫(yī)院制劑。

[通訊作者] 龔光明（1973-），男，博士，高級工程師;研究方向：微生物免疫學、藥物遞送、中藥制劑。