基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的二陳湯“異病同治”機(jī)制研究

丁珊珊，康 潔，黃益清，陳華琴，甘慧娟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

二陳湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由半夏、陳皮、茯苓、甘草等藥物組成，具有燥濕化痰、理氣和中的功效。 作為中醫(yī)經(jīng)典的化痰方，二陳湯被廣泛應(yīng)用于臨床，而且療效較為顯著。 包永生等［1］從文獻(xiàn)、臨床、藥理等方面對二陳湯的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，表明二陳湯及其加減方主要用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)中某些病癥痰證的治療，如慢性阻塞性肺炎（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）等。 那么，二陳湯治療不同疾病痰證的共同之處是什么？ 即二陳湯實現(xiàn)“異病同治”的物質(zhì)基礎(chǔ)是什么？ 隨著系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)概念的深入，研究者們將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一新的研究策略引入中醫(yī)藥學(xué)。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建中藥成分、靶點與疾病之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，對中藥復(fù)方的作用機(jī)制進(jìn)行研究，為從整體和系統(tǒng)地解決上述的問題提供了支撐。 因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對二陳湯治療不同疾?。–OPD、NAFLD、PCOS）痰證的靶點作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討二陳湯“同病異治”的作用機(jī)制。

1 方 法

1.1 二陳湯成分收集與篩選 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺［2］（TCMSP，http： ／ ／tcmspw.com ／tcmsp.php），在“herb name”檢索框中分別以“半夏”“陳皮”“茯苓”“甘草”為檢索詞進(jìn)行檢索，收集這4 味藥的化學(xué)成分信息。 對收集到的化學(xué)成分以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（druglikeness，DL）≥0.18 為篩選依據(jù)，篩選出二陳湯的活性成分。

1.2 二陳湯的作用靶點預(yù)測 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對篩選出的二陳湯的活性成分進(jìn)行作用靶點預(yù)測，然后利用 UniProt 數(shù)據(jù)庫（https： ／ ／www.uniprot.org／）中UniProtKB 檢索功能對預(yù)測出的作用靶點進(jìn)行逐一檢索，并在檢索結(jié)果中將物種限定為“human”，對所有預(yù)測到的二陳湯作用靶點進(jìn)行一一對應(yīng)的基因名稱（official gene symbol）轉(zhuǎn)換，獲得二陳湯活性成分的作用靶點。

1.3 疾病的治療靶點獲取 分別以“chronic obstructive pulmonary disease”“non-alcoholic fatty liver disease”“polycystic ovary syndrome”為檢索詞，在TTD數(shù)據(jù)庫（http：／ ／db.idrblab.net／ttd ／）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.drugbank.ca／）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https： ／ ／www.pharmgkb.org／）和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https： ／ ／www.genecards.org／）進(jìn)行檢索［3］，得到各個數(shù)據(jù)庫的疾病治療靶點，并去除重復(fù)項，分別獲取COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病的治療靶點。 利用Venny 2.1.0 在線工具繪制韋恩圖，將二陳湯的作用靶點與三種疾病的治療靶點進(jìn)行映射，獲得二陳湯治療這三種疾病的共同靶點。

1.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將二陳湯的單味藥-成分信息和成分-靶點信息導(dǎo)入Cytoscape 軟件（版本：3.2.1），分別繪制出二陳湯的單味藥-成分網(wǎng)絡(luò)和二陳湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，再利用Cytoscape 軟件中的“Merge”功能，將單味藥-成分網(wǎng)絡(luò)和成分-靶點網(wǎng)絡(luò)合并成二陳湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)［4-5］。 將預(yù)測、篩選、映射到的二陳湯治療COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病的共同靶點導(dǎo)入到 String 數(shù)據(jù)庫［6］（https： ／ ／stringdb.org／）“multiple proteins”檢索框中，物種設(shè)置為“homo sapiens”，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建二陳湯-疾病共同靶點之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)），并根據(jù)相關(guān)參數(shù)對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析 將構(gòu)建好的PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點，即共同靶點輸入到David 數(shù)據(jù)平臺［7］（https：／ ／david.ncifcrf.gov／），選 擇 類 型 為 “official gene symbol”，提交待分析基因列表，在Background中設(shè)置背景集為“homo sapiens”，選擇“Functional Annotation Tool”分析工具，對共同靶點進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 二陳湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集、篩選（OB≥30%、DL≥0.18）出二陳湯活性成分125 個，其中半夏13 個、陳皮 5 個、茯苓 15個、甘草92 個。 對以上活性成分進(jìn)行靶點預(yù)測，剔除未找到作用靶點的活性成分，獲得110 個化合物，其中半夏 12 個、陳皮 5 個、茯苓 6 個、甘草 87 個，見表1。 對所有預(yù)測到的作用靶點進(jìn)行基因名轉(zhuǎn)換后，保留唯一值，共獲得到259 個預(yù)測靶點。 將篩選、轉(zhuǎn)化后的二陳湯的單味藥、活性成分及作用靶點導(dǎo)入 Cytoscape 軟件（3.2.1 版本）構(gòu)建二陳湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1。 該網(wǎng)絡(luò)包含371 個節(jié)點，其中綠色節(jié)點為單味藥（4 個）、黃色節(jié)點為活性成分（110 個）、紅色節(jié)點為作用靶點（259 個）。

2.2 疾病共同作用靶點獲取 通過TTD、Drug-Bank、PharmGKB 和 GeneCards 數(shù)據(jù) 庫檢索得到 三種疾病治療靶點，對各個數(shù)據(jù)庫得到的治療靶點取并集、去重復(fù)項后，COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病分別獲得 1 631 個、411 個、568 個治療靶點，見表2。將二陳湯的作用靶點和三種疾病各自獲得的治療靶點分別輸入Venny 2.1.0 在線工具繪制韋恩圖，取交集，匹配得到二陳湯治療COPD、NAFLD、PCOS的共同靶點24 個，包括脂聯(lián)素（ADIPOQ）、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、小窩蛋白 1（CAV1）、CC 基序趨化因子 2（CCL2）、G1／S 特異性細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、細(xì)胞色素 P450 3A4（CYP3A4）、前表皮生長因子（EGF）、表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體（ESR1）、白介素-10（IL-10）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、胰島素（INS）、基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP－9）、原癌基因蛋白（MYC）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸肌醇3-磷酸酶和雙特異性蛋白磷酸酶（PTEN）、前列腺素 G／H 合酶 2（PTGS2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 3（STAT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤抗原 p53（TP53）、血管內(nèi)皮生長因子 A（VEGFA）。 見圖2。

表1 二陳湯活性成分

2.3 相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將24 個二陳湯治療COPD、NAFLD、PCOS 三種疾病的共同靶點輸入到String 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建出共同靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，見圖3。 該PPI 網(wǎng)絡(luò)包含24 個節(jié)點（即共同作用靶點），246 條節(jié)點連接線（連接線表示兩個節(jié)點之間存在相互作用，粗細(xì)代表相互作用關(guān)系的強(qiáng)弱）。 經(jīng)計算分析，該網(wǎng)絡(luò)平均度值為20.5（度值表示某一個節(jié)點與其他節(jié)點的連接數(shù)，度值越大，連接的節(jié)點數(shù)越多），其中 VEGFA、TP53、INS、IL-6、TNF、STAT3、PTGS2、MMP-9、MMP-2、CCL2、AKT1、ESR1、EGF、IL-10、PPARG 和 EGFR 等 16 個節(jié)點的度值高于平均度值，為該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點。

圖1 二陳湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 三種疾病相關(guān)靶點數(shù)

2.4 GO 富集分析 通過David 數(shù)據(jù)平臺對24 個共同靶點進(jìn)行GO 富集分析，獲得P＜0.05 的GO 條目 237 個，其中生物學(xué)過程（biological process，BP）條目 204 個、細(xì)胞學(xué)組分（cellular components，CC）條目 10 個、分子生物學(xué)功能（molecular function，MF）條目 23 個，展示 BP、CC 和 MF 分別富集到的基因數(shù)目排名前十的條目，見圖4。 這24 個共同靶點主要參與RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、一氧化氮生物合成、蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控、MAPK 和ERK 級聯(lián)、炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、衰老等生物學(xué)過程。

2.5 KEGG 信號通路富集分析 通過David 數(shù)據(jù)平臺對24 個共同靶點進(jìn)行KEGG 信號通路富集分析，根據(jù)P＜0.05 篩選到69 條信號通路，列出富集到的基因數(shù)目排名前20 條的信號通路，見表3。 24個共同靶點涉及到的信號通路類型主要有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 （PI3K-AKT 信號、FoxO 信號、HIF-1 信號、TNF 信號、MAPK 信號、JAK-STAT 信號等）、癌癥相關(guān)通路（膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、小細(xì)胞肺癌等）、肝病相關(guān)通路（乙型肝炎、非酒精性脂肪肝）和胰島素抵抗等。

圖2 二陳湯-疾病共同作用靶點韋恩圖

圖3 共同作用靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 共同靶點的GO 富集分析圖

表3 KEGG 信號通路富集分析結(jié)果（前20）

3 討 論

COPD 是以不可逆的氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病，中醫(yī)認(rèn)為COPD 多以肺、脾、腎虛虧為本，以痰濁、血瘀阻絡(luò)為標(biāo)；NAFLD 則是與胰島素抵抗密切相關(guān)的代謝性肝臟損傷，其基本病機(jī)是脾失健運、聚濕成痰、痰濕內(nèi)蘊(yùn)；而PCOS 是育齡期婦女多發(fā)且具有多因性、表現(xiàn)多態(tài)性的一組綜合征，主要由脾腎兩虛、肝氣郁滯、痰濕內(nèi)阻引起。二陳湯是經(jīng)典的祛痰祖方，臨床上經(jīng)常被作為基礎(chǔ)方用于治療痰濕證［8-10］。中醫(yī)提倡從整體出發(fā)，辨證論治，是臨床上“異病同治”的依據(jù)。 中藥復(fù)方對證治療、多成分多靶點的協(xié)同作用，是實現(xiàn)“異病同治”的手段。 然而，因中藥復(fù)方的多途徑多效應(yīng)特征，使其作用機(jī)制的研究受到挑戰(zhàn)。 近年來，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，將已知中藥活性成分與疾病治療靶點聯(lián)系起來，能夠從系統(tǒng)的角度探討中藥復(fù)方治療疾病的機(jī)制［11-13］。 因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對二陳湯異病同治COPD、NAFLD、PCOS 的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行分析。

本研究對二陳湯中四味中藥的活性成分進(jìn)行查詢、篩選，獲得110 個化合物，其中半夏12 個、陳皮5 個、茯苓 6 個、甘草 87 個，主要包含黃酮類化合物（黃芩苷、黃芩素、刺芒柄花素、光甘草素、光甘草定、柚皮素、橙皮素、川陳皮素、槲皮素、甘草苷、光甘草定等）、三萜類化合物（松苓新酸、16α-羥基松苓新酸、常春藤皂苷元、白樺脂酸等）、甾醇類化合物（豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇、星魚甾醇等），這些化合物已被報道具有抗癌、抗炎、抗細(xì)菌和抗氧化等生物學(xué)活性［5，14］。 這些活性成分共預(yù)測、篩選出259 個作用靶點，與查詢、篩選出的 COPD（1 631 個）、NAFLD（411 個）、PCOS（568 個）的疾病治療靶點匹配得到共同作用靶點24 個。

經(jīng) KEGG 信號通路分析富集到 PI3K-AKT、FoxO、HIF-1、TNF、MAPK、JAK-STAT、胰島素抵抗和癌癥相關(guān)等主要的信號通路。 這些信號通路在COPD、NAFLD、PCOS 治療和機(jī)制研究中均有報道，且通路之間存在著交互作用。 PI3K-AKT 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝中具有關(guān)鍵作用，被PI3K 磷酸化的AKT 能夠磷酸化很多底物分子，從而調(diào)控多種生物學(xué)效應(yīng)。 研究表明通過調(diào)節(jié)PI3K／AKT 信號通路，可以減輕胰島素抵抗，從而治療和改善NAFLD［15-16］和 PCOS［17-18］，也能夠減輕 COPD 的肺部和全身炎 癥反應(yīng)［19-20］。 FoxO 作為信號通路下游的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)葡萄糖、甘油三酯和膽固醇穩(wěn)態(tài)等一系列細(xì)胞功能，F(xiàn)oxO 的失調(diào)與 NAFLD 的發(fā)生有關(guān)［21］；PCOS 患者巨噬細(xì)胞中激活TLR4 炎癥信號通路的FoxO-1 磷酸化水平受到 AKT 的抑制［22］；FoxO3 在肺炎癥反應(yīng)和抗氧化基因的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，F(xiàn)oxO3 缺乏可導(dǎo)致 COPD 的發(fā)生［23］。 HIF-1 是低氧適應(yīng)的關(guān)鍵決定因素，可以防止NAFLD 進(jìn)展過程中肝臟過度的脂肪積聚［24］；HIF-1α 在 COPD 中 過表達(dá)，可能通過激活EGFR／PI3K／AKT 途徑上調(diào)炎癥因子的表達(dá)［25］；HIF-1α 信號 通路可能參 與了PCOS 患者子宮內(nèi)膜功能障礙的分子機(jī)制［26］。MAPK信號通路跟炎癥、凋亡、分化密切相關(guān)，研究顯示調(diào)節(jié)MAPK-JNK／P38 信號通路可改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的NAFLD，減輕炎癥反應(yīng)［27］，激活PI3K／AKT 和抑制MAPK 途徑降低大鼠模型系統(tǒng)的PCOS病理 和 胰島 素抵抗［28］，p38MAPK 和 ERK1 ／2 可以通過增加 MAFbx／Atrogin 和 MuRF1 的水平而調(diào)節(jié)肌肉蛋白的降解和萎縮［29］。 因此，二陳湯可通過交互調(diào)節(jié) PI3K-AKT、FoxO、HIF-1、MAPK 等信號通路對炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、糖脂代謝、平滑肌增殖等生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)整，從而起到化痰理氣的功效。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路和方法，從整體和系統(tǒng)的角度探討二陳湯化痰的物質(zhì)基礎(chǔ)及其“異病同治”的內(nèi)在機(jī)制。 然而，由于目前中藥復(fù)方成分信息和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫仍不完善，在一定程度上限制了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果，因此對于分析結(jié)果需要進(jìn)一步的實驗驗證［30-31］。