高效液相色譜法測定左金丸和左金膠囊中9種成分含量

宮玉婷，劉曉倩，陳雅然

（新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)藥品檢驗所，新疆 阿克蘇843000）

左金丸出自朱丹溪《丹溪心法·火六》[1]，由黃連與吳茱萸按6∶1的配伍比例組方，兩藥相伍，一寒一熱，辛開苦降，以苦降肝火為主，兼于辛開疏散火郁，對于肝經(jīng)火郁、津液未傷者，用之甚為恰當(dāng)[2]?？芍委熎⑽腹δ苁д{(diào)、應(yīng)激性胃潰瘍、急性胃黏膜損傷等胃腸道引起的消化系統(tǒng)疾病[3-5]，加味其他中藥可治療慢性胃炎、消化性潰瘍和膽汁反流性胃炎等胃腸道疾病[6-8]，效果佳且復(fù)發(fā)率低[10-11]。同時，左金丸對金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌等高度敏感，對大腸桿菌、痢疾桿菌等中度敏感[12]。陳懿[13]發(fā)現(xiàn)，左金丸能有效預(yù)防血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥，其作用機(jī)制可能與NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[14]。李冀等[15]用左金丸加味醫(yī)治牙痛，服用3劑后齒齦腫消痛止[16]。黃連Coptis chinensisFranch.屬毛茛科、黃連屬多年生草本植物，為常用中藥材。吳茱萸含有生物堿、黃酮類、香豆素、精油及其他成分，從吳茱萸中已分離鑒定出多種生物堿，主要有吲哚類、喹諾酮類、呋喃喹啉類和吖喧酮類生物堿，其中吳茱萸堿、去氫吳茱萸堿、吳茱萸次堿等[17-18]是主要化學(xué)成分；另外，吳茱萸中還包括苦味素類和揮發(fā)油類[19]。2015年版《中國藥典（一部）》中左金丸和左金膠囊的質(zhì)量控制方法之一是采用高效液相色譜（HPLC）法測定其鹽酸小檗堿含量，但未對其他活性成分進(jìn)行檢測。本研究中采用HPLC法同時測定左金丸和左金膠囊中表小檗堿、鹽酸小檗堿、去氫吳茱萸堿、黃連堿、檸檬苦素、鹽酸巴馬汀、吳茱萸堿、鹽酸藥根堿、吳茱萸次堿9種成分的含量，可為完善左金制劑的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)；同時應(yīng)用仿生提取法來模擬胃腸道環(huán)境，觀察不同比例配伍的黃連和吳茱萸藥材中有效成分的溶出狀況，為其臨床使用配比提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LQ-A20002型電子天平（丹佛儀器北京有限公司，精度為0.000 1 g）；安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；TG16-WS型臺式高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ-500VDB型三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為800 W，頻率為28/40 kHz）；800Y型高速多功能粉碎機(jī)（永康市柏歐五金制品有限公司）；QYC-200型恒溫振蕩器（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）。

圖1高效液相色譜圖

1.2 試藥

鹽酸小檗堿（批號為633-65-8，純度≥98%），鹽酸巴馬?。ㄅ枮?0605-02-4，純度≥98%），黃連堿（批號為3486-66-6，純度≥98%），鹽酸藥根堿（批號為960383-96-4，純度≥94%），吳茱萸堿（批號為518-17-2，純度≥98%），吳茱萸次堿（批號為84-26-4，純度≥98%），檸檬苦素（批號為1180-71-8，純度≥98%），表小檗堿（批號為6873-09-2，純度≥98%），均購自成都曼斯特生物科技有限公司；去氫吳茱萸堿（上海安奈德化學(xué)技術(shù)中心，批號為6588-15-3，純度≥98%）；左金丸（市售，溫州海鶴藥業(yè)有限公司，湖北香連藥業(yè)有限公司，批號分別為201906080，201911023）；左金膠囊（市售，溫州海鶴藥業(yè)有限公司，批號為201904120）；甲醇、乙腈，均為色譜純，均購自美國Tedia“天地”公司；娃哈哈純凈水；鹽酸、三乙胺、磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenexluna C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：含0.1%磷酸和0.05%三乙胺（A）-乙腈（B）水溶液，梯度洗脫，0～30 min時85%A→82%A，15%B→18%B；30～44 min時82%A→40%A，18%B→60%B；44～50 min時40%A→35%A，60%B→15%B；50～60 min時85%A→15%B；檢測波長：225 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：分別取表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、去氫吳茱萸堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿各2 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，分別加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃 度 為0.179，0.191，0.208，0.235，0.213，0.191，0.223，0.187，0.238 mg/mL的對照品溶液。精密量取上述溶液各100μL，混勻，即得混合對照品溶液。

供試品溶液：取左金丸（湖北、溫州）10丸，稱定質(zhì)量，放入研缽中研細(xì)，取細(xì)粉約0.1 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶中，加入80 mL甲醇-水-鹽酸（80∶20∶1，V/V/V）混合溶液，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，吸取適量溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液1，2。取左金膠囊，同法制備供試品溶液3。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果去氫吳茱萸堿、表小檗堿、鹽酸巴馬汀、檸檬苦素、黃連堿、吳茱萸堿、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、吳茱萸次堿的保留時間分別為24.51，21.44，34.64，45.33，23.62，47.52，22.43，36.32，48.54 min，各成分間分離度良好，拖尾因子在0.95～1.05之間。

線性關(guān)系考察：取9種對照品2 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入甲醇，充分溶解并稀釋至刻度，即得混合對照品溶液。表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、去氫吳茱萸堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的質(zhì)量濃度分別為0.165，0.205，0.202，0.203，0.203，0.205，0.201，0.201，0.204 mg/mL。分別取質(zhì)量濃度為200，100，40，20，10，4，2，1，0.5μg/mL的混合對照品溶液10μL，按質(zhì)量濃度從低到高注入色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 9種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果（n=9）

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、去氫吳茱萸堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的RSD分別為0.39%，0.29%，0.29%，0.41%，0.49%，0.83%，1.16%，0.12%，0.30%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：稱取同一左金膠囊粉末6份，每份0.1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、去氫吳茱萸堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為1.30%，0.46%，1.18%，0.22%，0.44%，0.24%，0.74%，3.80%，1.81%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一左金膠囊粉末，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別在0，2，4，8，12 h時各進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果表小檗堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、去氫吳茱萸堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為0.22%，0.13%，0.27%，0.11%，0.80%，0.79%，0.90%，2.30%，1.08%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：稱取已知含量的左金膠囊粉末0.025 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入各對照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并計算回收率。結(jié)果表小檗堿回收率為86.60%、RSD為5.03%，鹽酸藥根堿回收率為89.64%、RSD為4.90%，黃連堿回收率為86.22%、RSD為2.67%，去氫吳茱萸堿回收率為86.77%、RSD為5.86%，鹽酸巴馬汀回收率為96.89%、RSD為2.50%，鹽酸小檗堿回收率為86.52%、RSD為5.76%，檸檬苦素回收率為87.40%、RSD為5.14%，吳茱萸堿回收率為88.39%、RSD為5.76%，吳茱萸次堿回收率為88.14%、RSD為4.00%（n=6）。

2.4 樣品含量測定

取左金丸（溫州、湖北）、左金膠囊（溫州）適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定3種樣品中9種成分的含量。結(jié)果見表2?？梢姡蠼鹉z囊中除了鹽酸小檗堿的含量較低外，其他8個成分的含量均高于左金丸，其中表小檗堿的含量最高；不同廠家生產(chǎn)的左金丸含量也不相同。

2.5 黃連-吳茱萸藥對配伍比例確定

模擬胃液配置：精密吸取2.25 mL濃鹽酸，置250 mL容量瓶中，加入200 mL水，振搖混勻，再加2.5 mg胃蛋白酶，加水使其充分溶解，并稀釋至刻度，置于冰箱冷藏儲存。

表2左金膠囊和左金丸中9種成分的含量測定結(jié)果（mg/g）

模擬腸液配置：稱取1.402 7 g氫氧化鉀（KOH）固體，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，振搖混勻，得0.1 mol/L的KOH溶液，儲存于冰箱冷藏處，備用。

試驗設(shè)計與結(jié)果：將市售黃連、吳茱萸藥材分別經(jīng)藥材粉碎機(jī)粉碎成藥物粉末，裝袋，備用。稱取0.1 g不同比例黃連-吳茱萸藥材粉末（取用量見表3），置10 mL離心管中，加入2 mL人工胃液，37℃恒溫震蕩30 min，再用0.1 mol/L的堿溶液調(diào)節(jié)pH為6～8，再加入4 mg胰蛋白酶，恒溫震蕩30 min，再將離心管放入離心機(jī)中，以4 000 r/min離心4 min，取上清液置10 mL容量瓶中，加純凈水定容。取250μL藥液，置1.5mLEP管，加入750μL甲醇，渦旋30 s，放入離心機(jī)中，以10 000 r/min的速率離心5 min，取上清液，過濾，進(jìn)樣測定。結(jié)果見表4。

仿生提取是提取中藥復(fù)方化學(xué)成分的一種工藝手段，通過模擬人體胃腸道環(huán)境，其目的是提高有效成分。結(jié)果顯示，當(dāng)黃連-吳茱萸藥材配伍比例為6∶1時，有效成分含量最高，通過觀察不同比例配伍有效成分的溶出情況，可為其臨床使用配比提供參考。

表3不同配伍比例黃連-吳茱萸藥材取用量

表4不同配伍比例黃連-吳茱萸藥材中9種成分含量測定結(jié)果（mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

流動相選擇：分別考察乙腈-水（每1 000 mL中含1 mL磷酸）和乙腈-水（每1 000 mL中含1 mL磷酸、0.5 mL三乙胺）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，對目標(biāo)化合物的分離程度、雜質(zhì)峰的干擾、拖尾因子等進(jìn)行考察，最終確定乙腈-水（每1 000 mL中含1 mL磷酸、0.5 mL三乙胺）最佳流動相。

檢測波長選擇：為多種不同結(jié)構(gòu)的生物堿能同時測定，分別考察于210，225，265，280，360 nm波長處的9種成分，各成分在225 nm波長處的分離效果最好，最終確定225 nm為檢測波長。

3.2 溶液制備方法優(yōu)化

分別考察了鹽酸-甲醇（1∶100，V/V）、甲醇、甲醇-水（80∶20，V/V）和甲醇-水-鹽酸（80∶20∶1，V/V/V）超聲提取的效果，結(jié)果表明，甲醇-水-鹽酸對各待測成分提取率最高。采用單因素分析方法，對提取溶劑體積20，40，80，100 mL（甲醇-水-鹽酸，80∶20∶1，V/V/V）和超聲時間60，50，40，30，20，10 min分別進(jìn)行考察，且用80 mL超聲30 min時各待測成分的提取率最高。

3.3 不同制劑中9種成分測定結(jié)果

本研究中采用HPLC法對市售左金膠囊、左金丸（溫州、湖北）的9種成分的含量測定結(jié)果進(jìn)行了比較，2015年版《中國藥典（一部）》規(guī)定，左金膠囊每粒含黃連以鹽酸小檗堿計，不得少于40 mg，左金丸中每1 g含黃連以鹽酸小檗堿計，不得少于31 mg。本研究中所測左金膠囊每粒0.35 g中含有鹽酸小檗堿72.065 mg（大于40 mg）；左金丸（溫州）中每1 g含鹽酸小檗堿68.602 mg，左金丸（湖北）中每1 g含鹽酸小檗堿52.468 mg（均大于30 mg）。表明市售3種樣品均為合格產(chǎn)品，但不同廠家的不同制劑中這9種成分的含量不同。

3.4 方法評價

本研究中采用HPLC法，以乙腈-含0.1%磷酸和0.05%三乙胺的水溶液為流動性進(jìn)行梯度洗脫，建立了能同時測定左金丸和左金膠囊中9種成分含量的方法，該方法對該9種成分的分離效果及重復(fù)性均較好，簡便易行，為制劑的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。