替代對照品法測定復(fù)方甘草口服溶液中甘草苷和甘草酸含量

曾 芳，魏長勇，余敏靈

（四川省樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川 樂山614099）

復(fù)方甘草口服溶液是由甘草流浸膏、愈創(chuàng)甘油醚、復(fù)方樟腦酊等制成的復(fù)方制劑，鎮(zhèn)咳祛痰功效良好。2015年版《中國藥典（二部）》中未對甘草苷含量進(jìn)行控制，本研究中以甘草酸銨為對照品采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行甘草酸含量測定[1]。甘草酸銨易吸潮、價格貴，參考甘草、甘草流浸膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)文獻(xiàn)[2-9]，以橙皮苷為對照品替代甘草苷、甘草酸銨，采用替代對照品法，以色譜峰保留時間為輔助，并采用紫外光譜特征和純度檢查因子作定性鑒別；在定量分析中，通過測定橙皮苷和被測定物質(zhì)的相對校正因子，并運用校正因子計算甘草苷和甘草酸在制劑中的含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（包括DAD檢測器，Open-LAB CDS工作站，美國Agilent公司）；PE-A10型高效液相色譜儀（包括DAD檢測器，珀金埃爾默公司）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括DAD檢測器，賽默飛世爾公司）；XSE205型電子天平（梅特勒-托利多公司，精度為十萬分之一）；ULUP-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥

甘草苷對照品（批號為111610-201607，含量為93.1%），甘草酸銨對照品（批號為110731-201720，含量為97.7%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，含量為96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甘草酸單銨鹽A原料藥（批號為1707003，含量為67.2%，北京凱因科技股份有限公司）；復(fù)方甘草口服溶液（四川峨嵋山藥業(yè)股份有限公司，批號分別為20160701，20160702，20160703，20160704，20160705，20160706）；乙腈為色譜純，磷酸、甲醇、三乙胺均為分析純；復(fù)方樟腦酊、愈創(chuàng)甘油醚、甘油、濃氨溶液，均購自四川峨嵋山藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

對照品溶液：稱取甘草苷對照品17.84 mg，置100 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解，并定容至100 mL，作為貯備溶液A；稱取橙皮苷對照品64.12 mg，置250 mL容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至250 mL，作為貯備溶液B；稱取甘草酸銨對照品11.08 mg，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解，并定容至10 mL，作為貯備溶液C。分別量取貯備溶液A和貯備溶液B各1.00 mL、貯備溶液C 2.00 mL，置10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液，并定容至10 mL，作為混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品（批號為20160701）4mL，置50mL容量瓶中，加80%甲醇溶液，并定容至50 mL，即得。

樣品-橙皮苷混合溶液：另取樣品（批號為20160701）4 mL，置50 mL容量瓶中，加入貯備溶液B 5.00 mL，用80%甲醇定容至50 mL，即得。

陰性對照品溶液：取復(fù)方樟腦酊18 mL、愈創(chuàng)甘油醚0.5 g、甘油12 mL、濃氨溶液適量，加水至100 mL，搖勻，作為陰性樣品溶液；取上述溶液4 mL，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇定容至50 mL，作為陰性對照品溶液；以80%甲醇作為空白溶液。

2.2 測定波長選擇

提取混合對照品溶液和樣品-橙皮苷混合溶液色譜圖中甘草酸銨、甘草苷、橙皮苷色譜峰的紫外光譜圖，各組分在252 nm（甘草酸銨）、276 nm（甘草苷）、284 nm（橙皮苷）波長處有最大吸收（見圖1），故選擇252，276，284 nm分別作為甘草酸銨、甘草苷、橙皮苷的測定波長。

2.3 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.1%三乙胺（A，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），流動相B為乙腈，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；檢測波長：252 nm（甘草酸銨）、276 nm（甘草苷）、284 nm（橙皮苷）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.4 方法學(xué)考察

圖1紫外光譜圖

表1流動相梯度洗脫程序（%）

專屬性試驗：取2.1項下空白溶液、陰性對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液、樣品-橙皮苷混合溶液各10μL，按擬訂色譜條件分別注入色譜儀中，測定，色譜圖見圖2。在284，276，252 nm為檢查波長的色譜圖中，混合對照品溶液各組分主峰保留時間相同的位置上，樣品-橙皮苷混合溶液有相應(yīng)色譜峰，各色譜峰分離度均大于1.5；供試品溶液有與混合對照品溶液甘草酸銨和甘草苷保留時間一致的色譜峰，而無與混合對照品溶液橙皮苷保留時間一致的色譜峰；陰性對照品溶液和空白溶液均無在與混合溶液保留時間一致的色譜峰。與混合對照品溶液保留時間一致的樣品-橙皮苷混合溶液色譜圖中，甘草酸銨、甘草苷、橙皮苷紫外光譜最大吸收波長分別為252，276，284 nm。樣品-橙皮苷混合溶液色譜圖中，匹配因子分別為甘草酸銨999.928/1 000，甘草苷999.911/1 000，橙皮苷999.954/1 000。

精密度試驗：取2.1項下混合對照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，以每次甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷測定的峰面積計算。結(jié)果的RSD分別為0.35%，0.24%，0.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：精密量取樣品（批號為20160701）4 mL，依法制備供試品溶液共6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷峰面積的RSD分別為0.68%，0.22%，0.70%（n=6），表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗項下制備的供試品溶液10μL，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷峰面積的RSD分別為0.28%，0.33%，0.26%（n=7），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖2高效液相色譜圖

加樣回收試驗：稱取甘草酸單銨鹽A（批號為1707003，含量為67.2%）334.82 mg，置100 mL容量瓶中，用80%甲醇溶解并定容至100 mL，作為甘草酸單銨鹽A貯備液；取樣品（批號為20160701，每1 mL樣品中含甘草苷0.162 8 mg、甘草酸銨2.893 1 mg）2 mL，置50 mL容量瓶中，精密加入貯備溶液A 2 mL、甘草酸單銨鹽A貯備液2 mL、貯備溶液B 5 mL，用80%甲醇定容至50 mL，得供試品溶液，平行制備6份。取10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，按Cm=（Am×Cs）/（f×As）計算，Cm（μg）為回收率供試品溶液中甘草酸銨或甘草苷進(jìn)樣量，Am為回收率供試品溶液中甘草酸銨或甘草苷的峰面積，Cs（μg）為回收率供試品溶液中橙皮苷進(jìn)樣量，Cs為回收率供試品溶液中橙皮苷峰面積。結(jié)果見表2。

2.5 相對校正因子（f）值測定

取2.1項下混合對照品溶液2，5，10，15，20，25，30μL按擬訂色譜條件分別注入色譜儀，校正截距為0，以進(jìn)樣量（m，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以甘草酸銨和甘草苷曲線斜率分別除以橙皮苷曲線斜率計算f值，并以3臺不同液相色譜儀測定的平均值作為相對校正因子。結(jié)果甘草酸銨、橙皮苷、甘草苷線性回歸方程分別為A=803.233 3m，A=1 786.872 0m，A=1 932.570 7m，r分別為0.999 3，0.999 2，0.999 5；線 性 范 圍 分 別 為0.443 0～6.495 1μg，0.049 3～0.740 2μg，0.033 2～0.498 3μg。甘草苷相對校正因子fA為1.081 4（RSD=0.25%，n=3），甘草酸銨相對校正因子fB為0.449 2（RSD=0.22%，n=3）。

2.6 相對校正因子耐受性與相對保留時間(tR)考察

取2.1項下混合對照品溶液，以3臺不同高效液相色譜儀、不同柱溫（31.0，30.0，29.0℃）、不同測定波長（282/274/250 nm，283/275/251 nm，284/276/252 nm，285/277/253nm，286/278/254nm）、不同流動相pH（2.9，2.7，2.5）、不同流速（1.005，1.000，0.995 mL/min）的條件進(jìn)行測定，按2.5項下方法計算f值，以及橙皮苷色譜峰分別與甘草苷色譜峰和甘草酸銨色譜峰保留時間的比值。結(jié)果見表3，表明不同液相色譜儀、柱溫流動相pH、流速對tR無顯著影響。

2.7 紫外光譜穩(wěn)定性考察

取2.1項下混合對照品溶液，按2.6項下方法（除測定波長外）考察，提取橙皮苷、甘草酸銨、甘草苷紫外光譜圖。結(jié)果橙皮苷在（284±2）nm、甘草酸銨在（252±2）nm、甘草苷在（276±2）nm波長處均有最大吸收；各成分紫外光譜圖與各自對照品建立的紫外圖庫相比較，匹配因子均大于999.9/1 000。

2.8 樣品含量測定

取樣品4 mL，按2.1項下方法制備樣品-橙皮苷混合溶液和供試品溶液。取樣品-橙皮苷混合溶液和供品試溶液10μL，按2.3項下色譜條件，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并按回收試驗項下公式計算甘草酸銨和甘草苷進(jìn)樣量，通過進(jìn)樣量計算樣品中甘草酸和甘草苷含量，測定結(jié)果采用配對t檢驗，與外標(biāo)法測定數(shù)據(jù)無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表2加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

表3甘草苷和甘草酸銨相對校正因子耐受性試驗和相對保留時間考察結(jié)果

表4樣品含量測定結(jié)果（mg/mL）

3 討論

供試品溶液中定量加入替代對照品作為供試品溶液，替代對照品測定波長按試驗設(shè)計的色譜條件，在未加入替代對照品的供試品溶液的色譜圖中，不應(yīng)有與替代對照品溶液保留時間一致的色譜峰。

由于供試品溶液雜質(zhì)成分較多，對色譜柱有較高要求，未考察不同色譜柱相對保留時間的影響。參考國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH06492018，建議采用Welch Ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），本試驗中采用以相對保留時間為輔助，各組分色譜峰提取紫外光譜圖和對照品色譜峰所建立的紫外純度檢測圖庫比較為主的定性方法。由于工作站所建立的圖庫只能應(yīng)用于同類色譜儀，故使用局限性較大。

替代對照品內(nèi)加入法不需要單獨制備與測定對照品溶液，可縮短試驗時間，簡化檢驗程序?？赏瑫r進(jìn)樣測定待測組分和對照品，可降低儀器噪音和操作過程的影響，結(jié)果準(zhǔn)確，相對保留時間穩(wěn)定。