綠豆抗氧化肽的酶法制備及其抗氧化活性

夏吉安， 黃 凱， 李 森， 宋洪東， 管 驍

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093）

抗氧化性的多肽屬于天然抗氧化物，安全性高，可作為添加劑或者食品原料廣泛應(yīng)用于食品和藥品的生產(chǎn)中，具有較廣闊的發(fā)展前景[1-5]。

綠豆是一種在世界各地廣泛種植的豆科類植物，在我國有著悠久的種植歷史[6]。綠豆富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和多種維生素，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)19.5%～33.1%，是蛋白質(zhì)的良好來源[4]。綠豆蛋白主要包含球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白以及谷蛋白，其中球蛋白和清蛋白含量最多。綠豆蛋白質(zhì)是由17種氨基酸構(gòu)成，其中包括7種必需氨基酸[7]。綠豆肽是通過酶水解綠豆蛋白獲得的寡肽混合物，綠豆肽比綠豆蛋白具有更高的溶解度和吸水性，更低的黏度和更高的流動性。此外，綠豆肽還包含多種生物活性成分[8-9]。我國綠豆資源豐富，但是精深加工程度低，主要集中在綠豆淀粉的加工生產(chǎn)方面，綠豆蛋白則是綠豆淀粉加工過程中的廢棄物，其利用程度較低。使用酶解技術(shù)對綠豆蛋白進(jìn)行深度開發(fā)，制備具有抗氧化活性的綠豆多肽是提高綠豆資源利用率的有效途徑[10]。

作者以綠豆蛋白為原料，選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及中性蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)合，在不同酶解時間和加酶量的條件下對綠豆蛋白進(jìn)行酶解，得到綠豆抗氧化肽，并對其抗氧化活性進(jìn)行測定。最后，以凝膠過濾層析法分離純化最優(yōu)酶解條件下得到的酶解液，根據(jù)測定得到的體外抗氧化指標(biāo)，挑選出抗氧化性能最優(yōu)的組分，為綠豆抗氧化肽在天然抗氧化劑和保健食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

綠豆蛋白粉：購于陜西雙瑞生物科技有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）：購于西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；DPPH、中性蛋白酶（100 000 U/g）：購于上海維塔化學(xué)試劑有限公司；胰蛋白酶（50 000 U/g）、胃蛋白酶（1 200 U/g）：購于上海滬試化工有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒：購于碧云天生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鐵氰化鉀、無水三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸亞鐵銨、鹽酸、無水乙醇等試劑均為分析純試劑。

Synergy HTX多功能微孔板檢測儀：美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；HimacCR22N高速冷凍離心機(jī)：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；低溫恒溫槽：上海衡平儀器儀表廠產(chǎn)品；FE20 pH計、ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；酶反應(yīng)器：上海壘固儀器有限公司產(chǎn)品；IKARO5多點磁力攪拌器：艾卡儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆蛋白酶解液的制備方法 配制底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的綠豆蛋白溶液。用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液調(diào)節(jié)綠豆蛋白溶液的pH至蛋白酶的最適pH。稱取蛋白酶（加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%）加入綠豆蛋白溶液中，酶反應(yīng)器的溫度設(shè)定為該蛋白酶的最適溫度。使用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使得整個酶解過程中酶解液的pH始終在蛋白酶的最適pH區(qū)域。持續(xù)酶解3 h后，沸水浴10 min滅酶。將酶解液冷卻至室溫，置于低溫離心機(jī)中8 000 r/min離心10 min，取上清液即得到綠豆蛋白酶解液。

1.2.2 不同蛋白酶對綠豆蛋白酶解效果的影響選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別在各種蛋白酶的最適溫度、pH條件下對綠豆蛋白進(jìn)行酶解，酶解時間為3 h，通過測定酶解產(chǎn)物抗氧化活性來選取合適的蛋白酶。

1.2.3 組合酶對綠豆蛋白酶解效果的影響 分別配制5份底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的綠豆蛋白溶液，樣品從1—5編號。1號樣品為中性蛋白酶單酶水解4 h；2號樣品為中性蛋白酶水解3 h后堿性蛋白酶水解1 h；3號樣品為中性蛋白酶水解2 h后堿性蛋白酶水解2 h；4號樣品為中性蛋白酶水解1 h后堿性蛋白酶水解3 h；5號樣品為堿性蛋白酶單酶水解4 h。添加中性蛋白酶時調(diào)節(jié)pH至7，滅酶后再添加堿性蛋白酶時調(diào)節(jié)pH為8，在1—4號樣品中加入中性蛋白酶（加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%），在5號樣品中加入堿性蛋白酶（加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%），于50℃下酶解。1天后，將4號樣品取出沸水浴滅酶，再加入堿性蛋白酶繼續(xù)酶解，后續(xù)操作類似。整個酶解過程為4 h，使用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值，使得整個酶解過程中酶解液的pH始終為蛋白酶的最適pH。酶解結(jié)束后，將所有樣品滅酶，離心，取上清液測其體外抗氧化指標(biāo)[11]。

1.2.4 不同酶解時間對綠豆蛋白酶解效果的影響質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的綠豆蛋白溶液在加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、溫度50℃、pH 7的條件下，分別水解0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h后，取出30 mL酶解液，沸水浴滅酶10 min，再將樣品冷卻至室溫，8 000 r/min離心10 min，取上清液，測其體外抗氧化指標(biāo)[12]。

1.2.5 不同酶用量對綠豆蛋白酶解效果的影響質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的綠豆蛋白溶液在水解溫度50℃、pH為7.0、酶用量分別質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%的條件下，水解3 h，沸水浴滅酶10 min，再將樣品冷卻至室溫，8 000 r/min離心10 min，取上清液，測其體外抗氧化指標(biāo)[13]。

1.2.6 綠豆蛋白酶解液的分離純化 采用凝膠過濾層析法對綠豆蛋白酶解液（酶解條件：中性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、溫度50℃、pH 7.0、水解3 h）進(jìn)行分離純化。選用SephadexG-25填料，將處理好的填料裝入層析柱中。凝膠柱通過預(yù)處理、裝柱、平衡后，緩慢加入經(jīng)0.45μm超濾膜過濾后的樣品，樣品質(zhì)量濃度為100 mg/mL，進(jìn)樣量為3 mL。洗脫液為去離子水，洗脫流量控制在0.7 mL/min，每10分鐘收集一管，紫外檢測波長220 nm，收集各峰處的洗脫液后濃縮，測定蛋白質(zhì)濃度以及體外抗氧化指標(biāo)[14]。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的測定 用無水乙醇配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將1 mL測試樣品溶液加入到1 mL DPPH溶液中，混勻，室溫下避光靜置30 min后在517 nm處測定其吸光度，同時測定1 mL DPPH溶液與1 mL乙醇混合后的吸光度，以及1 mL測試樣品溶液與1 mL無水乙醇混合后的吸光度，計算清除率[15]。

1.2.8 還原能力的測定 取0.4 mL樣品和1 mL PBS（pH 6.6，0.2 moL/L）以及1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀溶液混合，50℃水浴20 min，冷卻后加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸溶液混勻，靜置15 min。取1 mL上清液，加入0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%三氯化鐵溶液和1 mL去離子水。10 min后，把樣品吸入96孔板中，在700 nm處測吸光度，吸光度值越高，則還原能力越強(qiáng)[16]。

1.2.9 羥基（OH）自由基清除能力的測定 采用Fenton反應(yīng)法，取1 mL樣品溶液分別加入1 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液以及1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，混勻，于510 nm處測定吸光度，用去離子水代替樣品溶液測定吸光度，用去離子水代替過氧化氫溶液測定吸光度，計算清除率[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果分析取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用GraphPad Prism 17.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

選用中性蛋白酶（反應(yīng)溫度50℃，pH 7）、堿性蛋白酶（反應(yīng)溫度50℃，pH 8）、胰蛋白酶（反應(yīng)溫度50℃，pH 8）、胃蛋白酶（反應(yīng)溫度37℃，pH 2）4種蛋白酶酶解綠豆蛋白，酶解時間為3 h，酶用量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，測定酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性圖1（a）為各蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率，由圖可以看出各蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率均高于未經(jīng)過酶解的綠豆蛋白溶液，其中中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的清除率明顯高于其他3種蛋白酶的酶解產(chǎn)物，并且可以看出DPPH自由基清除率與酶解產(chǎn)物的濃度呈正相關(guān)性。隨著酶解產(chǎn)物濃度的增大，DPPH自由基清除率逐步增大，抗氧化能力越強(qiáng)。圖1（b）為各酶解產(chǎn)物的還原能力，與DPPH自由基清除率相同，各蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原能力均高于未經(jīng)過酶解的綠豆蛋白液，其中中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原能力略高于其他3種蛋白酶的酶解產(chǎn)物。同樣可以看出，還原能力與酶解產(chǎn)物的濃度也呈正相關(guān)。隨著酶解產(chǎn)物濃度的增大，吸光度值越高，抗氧化能力越強(qiáng)。

選用中性蛋白酶與堿性蛋白酶組合酶解綠豆蛋白，測定酶解產(chǎn)物的抗氧化能力。圖2（a）為酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率，由結(jié)果可知，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率明顯高于組合酶以及堿性蛋白酶酶解的產(chǎn)物，且隨著中性蛋白酶酶解時間減少以及堿性蛋白酶的酶解時間增加，清除率呈下降趨勢。圖2（b）為酶解產(chǎn)物的還原能力，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的還原能力與組合酶相當(dāng)，略高于堿性蛋白酶酶解的產(chǎn)物。

圖1 不同蛋白酶酶解綠豆蛋白產(chǎn)物的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant ability of different proteases to enzymolysis mung bean protein products

綜合各蛋白酶以及組合酶酶解綠豆蛋白產(chǎn)物的抗氧化能力來看，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化效果最好，可作為制備綠豆抗氧化肽的最優(yōu)蛋白酶。此結(jié)果也與李琴等人的實驗結(jié)果相符[13]。

圖2 組合酶酶解綠豆蛋白產(chǎn)物的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant ability of combined enzymes to enzymolysis mung bean protein products

2.2 酶解時間的選擇

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的綠豆蛋白在加酶量質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%（中性蛋白酶）、溫度50℃、pH 7的條件下，分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h后，滅酶取上清液后測其抗氧化指標(biāo)。從圖3（a）中可以看出，隨著酶解時間的增加，酶解產(chǎn)物的DPPH清除率呈現(xiàn)出先增長后減緩的趨勢，并在3 h處達(dá)到清除率的頂峰。從圖3（b）中可以發(fā)現(xiàn)，酶解產(chǎn)物的還原能力相差不大，3 h處的還原能力略高于其他時間。分析原因可能是，酶解時間不足3 h時，水解不夠充分，當(dāng)酶解時間超過3 h時，水解過度，綠豆蛋白被水解成了抗氧化活性較差的寡肽或者游離氨基酸，因而水解產(chǎn)物的抗氧化活性降低。所以選擇酶解時間為3 h。

2.3 加酶量的選擇

圖3 不同酶解時間綠豆蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant ability of mung bean proteolysis products with different enzymatic time

底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的綠豆蛋白在水解溫度50℃、pH 7、中性蛋白酶加酶量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為2%、4%、6%、8%、10%的條件下，水解3 h，然后滅酶，離心取上清液，測體外抗氧化指標(biāo)。圖4（a）為DPPH自由基清除率，隨著酶用量的增大，清除率先減小后緩慢增加，加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%時DPPH自由基清除率為最大值。圖4（c）為羥基自由基清除率，與DPPH自由基清除率變化相同，也是隨著酶用量的增大，清除率先減小后緩慢增大，加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%時，羥基自由基清除率為最大值。分析原因可能是，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時，隨著加酶量的增加，綠豆蛋白被充分水解成了抗氧化活性相對較差的肽段。圖4（b）為還原能力與酶解時間關(guān)系，由圖可知，各組之間的還原能力差距不大，隨著酶用量的增大，還原能力略微增大，而且還原能力的體系所呈現(xiàn)出的組間差別并沒有清除率那么大。綜合DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及生產(chǎn)成本的角度來看，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的加酶量為最適加酶量條件。

圖4 不同加酶量綠豆蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant ability of mung bean proteolysis products with different enzyme contents

2.4 優(yōu)化酶解條件下綠豆蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化能力

根據(jù)前期對綠豆蛋白酶解條件優(yōu)化實驗的結(jié)果，得出最優(yōu)酶解條件：用中性蛋白酶酶解綠豆蛋白，在pH 7、溫度50℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的條件下，酶解3 h，后滅酶，離心取上清液，最后凍干得到綠豆肽，測定其抗氧化能力。圖5（a）中可看出，DPPH自由基清除率與酶解得到綠豆肽的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，隨著綠豆肽質(zhì)量濃度的增大，其DPPH自由基清除率逐漸增大，這與酶種類選擇的實驗中酶解產(chǎn)物的濃度與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)的結(jié)論一致。質(zhì)量濃度為1、5、10 mg/mL的綠豆肽DPPH自由基清除率分別是（29.37±0.9）%、（91.58±2.44）%、（96.16±2.2）%，其中5 mg/mL綠豆肽的DPPH自由基清除率與圖5（c）中500μg/mL谷胱甘肽的DPPH自由基清除率相當(dāng)，說明該綠豆肽具有較好的抗氧化能力。圖5（b）中可以看出，還原能力與酶解得到綠豆肽的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，隨著綠豆肽質(zhì)量濃度的增大，其DPPH自由基清除率逐漸增大，這同樣與酶種類選擇的實驗中酶解產(chǎn)物的質(zhì)量濃度與還原能力呈正相關(guān)的結(jié)論一致。質(zhì)量濃度為1、5、10 mg/mL綠豆肽的吸光度值分別為0.11±0.01、0.18±0.01、0.31±0.03，吸光度值逐漸增大，還原能力也逐漸增強(qiáng)，其中5 mg/mL綠豆肽的還原能力與圖5（d）中100μg/mL谷胱甘肽的還原能力相當(dāng)，表明了優(yōu)化酶解條件下綠豆蛋白酶解產(chǎn)物具有較好的抗氧化能力。

圖5 優(yōu)化酶解條件下綠豆蛋白酶解產(chǎn)物以及谷胱甘肽的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant capacity and mung bean proteolysis products under optimal enzymatic conditions

2.5 優(yōu)化酶解條件下綠豆肽的分離純化及其抗氧化活性

將優(yōu)化酶解條件后得到的綠豆肽用凝膠過濾層析法分離純化，收集峰值處組分，測其體外抗氧化指標(biāo)。從圖6中可以看出，洗脫過程中按照洗脫時間的先后順序共出現(xiàn)5個明顯的峰，分別收集得到組分1—5，測其體外抗氧化指標(biāo)與未分離多肽的抗氧化指標(biāo)進(jìn)行比較。圖7（a）為未分離多肽與分離的5個組分的DPPH自由基清除率，由圖可知，未分離多肽的自由基清除率高于組分2和組分3，但是低于組分1、組分4和組分5。組分5的清除率最高，為組分4清除率的2.6倍；其次是組分1，為組分4的2倍。圖7（b）為未分離多肽與分離的5個組分的還原能力，與DPPH自由基清除率的結(jié)果相似，組分5的還原能力最高，是組分4的4.7倍。按照圖6中出峰時間來判斷，組分5出峰時間最晚，為相對分子質(zhì)量較小的肽段，該分析結(jié)果也符合其他參考文獻(xiàn)的結(jié)論，即相對分子質(zhì)量較小肽段的抗氧化能力超過相對分子質(zhì)量較大肽段和未分離多肽[2，18-19]。因此，小分子肽段組分5可作為綠豆蛋白酶解得到的抗氧化性能最好的蛋白肽段。而組分5的進(jìn)一步分離純化以及鑒定工作則需要在后續(xù)的實驗中繼續(xù)探究。

圖6 綠豆肽層析圖譜Fig.6 Mung bean peptide chromatogram

圖7 綠豆肽分離組分抗氧化能力Fig.7 Antioxidant ability of mung bean peptide separation components

3 結(jié)語

以綠豆蛋白為原料，分別選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及組合酶分別在其最適溫度、pH條件下對綠豆蛋白酶解，再用酶解時間和加酶量作為單因素條件，以DPPH自由基清除率、還原能力以及羥基自由基清除率作為判斷酶解效果的指標(biāo)。得到了綠豆蛋白最佳酶解條件為：中性蛋白酶酶解，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，酶解時間3 h，加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，pH 7.0，溫度50℃，該條件下制備的綠豆蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化性能最好。質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，DPPH自由基清除率已高達(dá)（91.58±2.44）%，與500μg/mL谷胱甘肽的DPPH自由基清除率相當(dāng)，且具有較強(qiáng)的還原能力。另通過凝膠過濾層析分離綠豆肽，測其抗氧化能力，相對分子質(zhì)量較小的肽段組分5為抗氧化效果最好的肽段。