DNA甲基化在心肌缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

向 岑綜述，王海英，魏義勇審校

0 引 言

隨著人口老齡化日漸加重，心血管疾病的發(fā)病率逐年增加。缺血性心肌病成為全世界人類死亡和致殘的主要原因。當(dāng)前，治療心肌缺血的有效方法是盡早恢復(fù)心臟灌注，保護(hù)剩余存活心肌。近年來(lái)，血管成形術(shù)、體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)及溶栓術(shù)等得到普及，使缺血心肌得到了早期復(fù)灌，但是快速再灌注引起心肌細(xì)胞代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞[1]，最終導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)。缺血、缺氧、炎癥、自噬、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等均參與MIRI的病理過(guò)程[2]。長(zhǎng)時(shí)間的心肌組織缺血使得ATP生成減少、細(xì)胞內(nèi)pH降低，導(dǎo)致無(wú)氧代謝增強(qiáng)和乳酸蓄積。ATP酶依賴性離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能受損，細(xì)胞離子調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)和線粒體鈣超載，細(xì)胞腫脹、裂解，細(xì)胞凋亡、壞死和自噬，引起細(xì)胞死亡[3]。再灌注時(shí)，產(chǎn)生大量的活性氧(reactice oxygen species, ROS)，促炎性免疫細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和趨化因子釋放增加，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重缺血組織損傷。此外，MIRI還會(huì)引起缺血心肌表觀遺傳改變[4]。了解MIRI誘導(dǎo)的心肌表觀遺傳變化并研究具體機(jī)制將有助于研發(fā)新的治療藥物。

表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列不改變的情況下，研究基因表達(dá)的可遺傳變化。表觀遺傳修飾使細(xì)胞表型發(fā)生改變而基因型不變，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。3種常見(jiàn)的表觀遺傳修飾類型是組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化以及DNA甲基化[5-6]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中研究的最廣泛，最重要的表觀遺傳類型。DNA甲基化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病等。識(shí)別與疾病相關(guān)的DNA甲基化標(biāo)志物有益于我們了解表觀遺傳學(xué)在疾病病理生理學(xué)中的作用。本文就DNA甲基化在MIRI中的作用和研究前景作一綜述。

1 DNA甲基化

1.1 DNA甲基化的概述及其生物功能DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMTs)催化下，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5-mC)的一種生化反應(yīng)[7]。胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤(cytosine-phosphate-guanosine-, CpG)是DNA甲基化發(fā)生的主要位點(diǎn)，哺乳動(dòng)物的基因組序列約60%～90%的CpG均呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)[8]。在許多疾病中，DNA甲基化發(fā)生在CpG島及其周圍，并且這種甲基化的改變可調(diào)控基因表達(dá)。研究證實(shí)，靶基因啟動(dòng)子的高甲基化抑制基因表達(dá)，而低甲基化激活基因表達(dá)。5-mC在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞程序性增殖分化、衰老等生理過(guò)程中均能影響蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，從而調(diào)控基因表達(dá)[9]。

1.2 DNA甲基化與MIRI氧化應(yīng)激和缺氧是缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)過(guò)程中常見(jiàn)的病理反應(yīng)，兩者均可能影響DNA甲基化。氧化應(yīng)激可通過(guò)堿基修飾或缺失、染色體重排和其他表觀遺傳修飾改變DNA結(jié)構(gòu)。DNA損傷可能影響DNMTs活性，從而改變DNA甲基化水平并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[10]。十-十一易位甲基胞嘧啶雙加氧酶(Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase, TET)可以將5-mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5-hmC)，5-hmC進(jìn)一步氧化，實(shí)現(xiàn)低甲基化。該過(guò)程需要氧氣供應(yīng)，缺氧則抑制該反應(yīng)[11-12]。因此，I/R時(shí)發(fā)生心肌組織缺氧可誘導(dǎo)TET活性降低，從而激活靶基因啟動(dòng)子片段高甲基化，抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，干擾與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬和凋亡等相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2 DNA甲基化調(diào)控靶點(diǎn)與MIRI

2.1 磷酸酶和張力蛋白同源誘導(dǎo)的激酶1(phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase 1, Pink1)自噬是指將細(xì)胞內(nèi)成分和細(xì)胞器傳遞至溶酶體進(jìn)行降解的生理過(guò)程。細(xì)胞自噬參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在維持細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、衰老、凋亡，以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用[13]。細(xì)胞內(nèi)自噬選擇性作用于線粒體即為線粒體自噬。線粒體自噬通過(guò)選擇性清除受損線粒體維持細(xì)胞能量代謝和線粒體功能。適度自噬可清除受損細(xì)胞器，挽救瀕死細(xì)胞。過(guò)度激活自噬，卻會(huì)引起細(xì)胞自噬性死亡[14]。Pink1是一種具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的線粒體外膜蛋白，可作為線粒體損傷的感受器和Pink/Parkin線粒體自噬通路的引發(fā)劑[15]，廣泛表達(dá)于心肌、骨骼肌以及神經(jīng)系統(tǒng)等高耗能組織。應(yīng)激狀態(tài)下，ROS引起線粒體損傷，導(dǎo)致Pink1蓄積在線粒體外膜，通過(guò)自身磷酸化與細(xì)胞內(nèi)分子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。Pink1參與線粒體自噬相關(guān)的多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在維護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、線粒體功能以及機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。然而，近年來(lái)，越來(lái)越多證據(jù)表明Pink1因外界刺激不同或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的改變對(duì)線粒體自噬產(chǎn)生不同影響。Zhou等[18]建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型分析Pink1/FAM65B通路抑制自噬抗MIRI的作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)circRNA(autophagy related circRNA, ACR)與DNMT3B結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)抑制DNMT3B介導(dǎo)的Pink1啟動(dòng)子DNA甲基化，從而增加Pink1表達(dá)，激活Pink1/FAM65B通路，抑制過(guò)度自噬，從而減輕MIRI。因此，深入研究Pink1以及相關(guān)通路的DNA甲基化機(jī)制有利于發(fā)現(xiàn)治療和預(yù)防MIRI的新靶點(diǎn)。

2.2 MicroRNA(miRNA)miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小核糖核酸，包含21～24個(gè)核苷酸[19]。miRNA參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，如自噬[20]、增殖、分化和凋亡[21]，通過(guò)靶基因與3′UTR的結(jié)合而負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)[22]。miRNA對(duì)自噬的調(diào)控是由自噬相關(guān)基因如BECN1，LC3B和p62介導(dǎo)的[23]。有研究證實(shí)，心臟重塑和心力衰竭等病理生理過(guò)程會(huì)影響miRNA豐度[24-25]。如在大鼠心肌I/R模型的心臟組織中發(fā)現(xiàn)miRNA30a異常表達(dá)[26]。miRNA異常表達(dá)可能與表觀遺傳調(diào)控有關(guān)，如DNA甲基化和組蛋白修飾[27]。miRNA啟動(dòng)子DNA甲基化水平的改變可直接導(dǎo)致其表達(dá)水平改變[28]。Vera等[29]報(bào)道，miR-7甲基化水平升高可能是潛在的臨床表觀遺傳靶點(diǎn)，可用于識(shí)別對(duì)鉑衍生療法反應(yīng)不良的卵巢癌患者。Wang等[30]利用UCSC基因組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)miR-30a全基因組存在2個(gè)CpG島，其中miR-30a(-761/-216)片段是核心調(diào)控區(qū)，為甲基化提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。同時(shí)用DNMTs抑制劑處理心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DNMT3B抑制劑顯著增強(qiáng)miR-30a的表達(dá)，而使用DNMT1和DNMT3A抑制劑未觀察到明顯作用?；蚯贸鼶NMT3B可抑制miR-30a甲基化，同時(shí)心肌細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平升高。此外，細(xì)胞活力染色發(fā)現(xiàn)，在缺氧/復(fù)氧條件下，DNMT3B抑制劑可增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力。這些結(jié)果均提示，在缺氧后處理下，DNMT3B介導(dǎo)的miR-30a啟動(dòng)子DNA甲基化水平降低，從而上調(diào)miR-30a表達(dá)，miR-30a通過(guò)抑制BECN1介導(dǎo)的自噬發(fā)揮心肌保護(hù)作用。該發(fā)現(xiàn)支持DNA低甲基化會(huì)導(dǎo)致基因不穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄激活，而DNA高甲基化會(huì)導(dǎo)致基因沉默這一觀點(diǎn)。這為進(jìn)一步探究miRNA抗MIRI的心肌保護(hù)作用機(jī)制提供了新方向，而且為減輕I/R引起的心肌損傷提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

2.3 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體2(corticotropin releasing hormone receptor 2, CRHR2)CRHR2是蛋白質(zhì)編碼基因。該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于G蛋白偶聯(lián)受體2家族，是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體的亞家族。 該受體對(duì)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone, CRH)具有很高的親和力，并與CRH相關(guān)肽(如尿皮質(zhì)素)結(jié)合[31]。CRHR2主要分布于心臟，該受體可能參與介導(dǎo)心血管穩(wěn)態(tài)[32]。Urocortin(UCN)是CRH家族中的一種肽，已經(jīng)證實(shí)具有抗I/R損傷的心肌保護(hù)作用[33]。大量研究表明，雌激素通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性因子發(fā)揮心臟保護(hù)作用。如雌激素可增加熱休克蛋白的表達(dá)，減少活性氧的產(chǎn)生，抑制促炎基因表達(dá)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血性損傷[34]。研究證實(shí)，雌激素維持心肌CRHR2表達(dá)，增強(qiáng)UCN誘導(dǎo)的抗I/R損傷的心臟保護(hù)作用。維持CRHR2表達(dá)水平對(duì)內(nèi)源性UCN發(fā)揮心臟保護(hù)作用至關(guān)重要[35]。CRHR2近端啟動(dòng)子包含53個(gè)CpG位點(diǎn)，這提示甲基化可能會(huì)調(diào)節(jié)CRHR2表達(dá)。Cong等[35]進(jìn)一步研究卵巢切除術(shù)和雌激素替代療法是否影響甲基化。結(jié)果表明，在假手術(shù)組、卵巢切除組、卵巢切除聯(lián)合雌激素替代療法組之間CRHR2 CpG島中的每個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化頻率差異明顯。與假手術(shù)組相比，卵巢切除組中7個(gè)CpG位點(diǎn)DNA甲基化頻率顯著增加。提出雌激素可能通過(guò)表觀遺傳機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。該團(tuán)隊(duì)在2014年證明在心肌細(xì)胞中雌激素通過(guò)DNA甲基化調(diào)節(jié)CRHR2表達(dá)[36]，這為了解雌激素的心臟保護(hù)作用機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

2.4 蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)PKC是磷脂依賴性Ca2+激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶。蛋白激酶C是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要介質(zhì),也是細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[37]。PKC激活會(huì)觸發(fā)許多細(xì)胞內(nèi)事件，這些事件會(huì)影響心臟的多個(gè)生理過(guò)程，包括心率，收縮和舒張功能。最近研究表明PKC的激活與多種心血管疾病的病理生理有關(guān)。心肌缺血預(yù)處理釋放的內(nèi)源性介質(zhì)(如腺苷)通過(guò)作用于G蛋白偶聯(lián)受體啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而通過(guò)二酰基甘油激活PKC，隨后，活化的PKC磷酸化第二個(gè)效應(yīng)蛋白發(fā)揮心臟保護(hù)作用。PKC有11個(gè)亞型，其中PKC-α, PKC-β, PKC-ε, PKC-ζ在胎兒心臟中高度表達(dá)。研究證實(shí)PKC-ε在缺血性心肌病中發(fā)揮重要作用[37]。然而，PKC-ε如何參與心肌保護(hù)作用的生理機(jī)制仍不清楚。有研究表明，母體缺氧會(huì)導(dǎo)致胎兒心臟PKC-ε啟動(dòng)子甲基化以及基因表達(dá)模式發(fā)生表觀遺傳抑制，從而雄性子代心臟對(duì)缺血再灌注損傷的敏感性增加[38-39]。為進(jìn)一步研究缺氧誘導(dǎo)因子1或ROS介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的PKC-ε基因抑制的分子機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)利用妊娠期大鼠缺氧模型以及離體胎鼠心臟組織和大鼠胚胎心肌細(xì)胞缺氧模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，缺氧導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞和胎鼠心臟ROS生成增加，使用ROS清除劑N-乙?；?L-半胱氨酸可抑制缺氧介導(dǎo)的SP1結(jié)合位點(diǎn)的甲基化，并且恢復(fù)PKC-ε啟動(dòng)子與SP1結(jié)合，提示缺氧產(chǎn)生的ROS在胎鼠心臟PKC-ε啟動(dòng)子DNA甲基化中發(fā)揮重要作用。此外，使用甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷抑制缺氧對(duì)PKC-ε基因表達(dá)下調(diào)的影響，從而使PKC-ε和mRNA恢復(fù)可控水平，證明了DNA甲基化在缺氧誘導(dǎo)的PKC-ε基因抑制中的表觀遺傳作用。研究證實(shí)ROS介導(dǎo)PKC-ε啟動(dòng)子特定序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的CpG甲基化，從而調(diào)節(jié)PKC-ε基因在胎鼠心臟的表達(dá)，導(dǎo)致子代心臟對(duì)I/R損傷的敏感性增強(qiáng)。

2.5 冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(cold-inducible RNA binding protein, CIRBP)CIRBP是細(xì)胞核RNA結(jié)合蛋白家族成員，在冷刺激下，CIRBP從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)調(diào)節(jié)靶mRNA，抑制細(xì)胞凋亡[40]。Liu等[41]通過(guò)建立大鼠體外循環(huán)模型，發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)期間低溫可誘導(dǎo)心臟CIRBP的表達(dá)，而抑制此蛋白表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致心臟功能顯著受損。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因大鼠、心肌細(xì)胞培養(yǎng)等一系列研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期慢性低氧會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生甲基化的表觀遺傳學(xué)改變，導(dǎo)致CIRBP表達(dá)下降，并且喪失對(duì)低溫的反應(yīng)性。低溫抑制CIRBP表達(dá)，可導(dǎo)致體外循環(huán)期間心肌組織的泛醌合成障礙、輔酶Q10的合成銳減，最終削弱低溫的心肌保護(hù)效應(yīng)。通過(guò)在心臟停搏液中補(bǔ)充額外的輔酶Q10可彌補(bǔ)冷刺激后CIRBP下降帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)。

3 線粒體基因組(mitochondrial DNA, mtDNA)

mtDNA位于線粒體內(nèi)膜和電子傳輸鏈，易受到氧化應(yīng)激損傷。mtDNA由16.5kb雙鏈DNA組成，無(wú)內(nèi)含子，并且在電子傳輸鏈中編碼復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ以及tRNA和rRNA。因此，若mtDNA發(fā)生任何損傷均可能導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)錄功能異常以及氧化磷酸化功能障礙[42]。Yue等[43]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠心臟I/R過(guò)程中，mtDNA轉(zhuǎn)錄水平降低以及mtDNA復(fù)制減少，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸鏈復(fù)合物合成減少，抑制線粒體生物發(fā)生，最終誘導(dǎo)線粒體功能障礙，而且線粒體功能障礙又誘導(dǎo)ROS生產(chǎn)增加，加重mtDNA損傷，誘發(fā)心肌細(xì)胞損傷。線粒體是將環(huán)境刺激轉(zhuǎn)化為表觀遺傳調(diào)控的重要場(chǎng)所。盡管表觀遺傳學(xué)變化主要與核DNA有關(guān)，但研究表明，mtDNA的表觀遺傳調(diào)控影響線粒體功能[44]。線粒體表觀遺傳學(xué)相關(guān)研究尚處于起步階段，需進(jìn)一步深入分析以揭示mtDNA甲基化對(duì)心血管疾病的影響。

4 結(jié) 語(yǔ)

盡管目前對(duì)MIRI的病理生理和分子機(jī)制有大量研究，但是將這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床實(shí)踐仍然受限。靶基因DNA甲基化影響基因轉(zhuǎn)錄，從而參與調(diào)節(jié)I/R引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、免疫、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程。進(jìn)一步研究表觀遺傳調(diào)控在MIRI中的最新進(jìn)展有助于我們探索相關(guān)靶點(diǎn)，如Pink1，miRNA，CRHR2，PKC，mtDNA等在減輕MIRI中的分子機(jī)制。