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    梯度洗脫波長切換HPLC同時測定茵梔解毒顆粒中3個成分的含量

    2020-12-11 09:18鄭舉劉紅云陳靜
    安徽農(nóng)業(yè)科學 2020年21期
    關鍵詞:梔子綠原黃芩

    鄭舉 劉紅云 陳靜

    摘要 [目的]建立同時測定茵梔解毒顆粒中綠原酸、黃芩苷、梔子苷3個成分含量的方法。[方法]采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈(A)~0.2% 磷酸水溶液(B)為流動相,梯度洗脫,流速1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長327 nm(0~9.5 min,測定綠原酸)、238 nm(9.5~14.0 min,測定梔子苷)、278 nm(14~30 min,測定黃芩苷)。[結(jié)果]各待測組分分離度良好;綠原酸、黃芩苷、梔子苷3個成分的進樣量分別在5.01~100.00 μg/mL(r=0.999 7)、6.25~100.00 μg/mL(r=0.999 5)、10.86~400.00 μg/mL (r=0.999 3)與峰面積呈良好的線性關系;加樣回收率分別為98.5%、100.0%、99.0%(n=6),RSD分別為0.2%、0.7%、0.4%。[結(jié)論]該試驗建立的含量測定方法符合方法學驗證要求,可用于茵梔解毒顆粒的3個指標性成分的同時測定。該方法簡便、準確度高、重復性好,為進一步控制茵梔解毒顆粒的質(zhì)量標準提供了依據(jù)。

    關鍵詞 茵梔解毒顆粒;綠原酸;黃芩苷;梔子苷;含量測定;高效液相色譜;梯度洗脫;波長切換

    中圖分類號 R284.1 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611(2020)21-0198-04

    Abstract [Objective]To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid, baicalin and geniposide in Yinzhi Jiedu granules.[Method]The chromatographic separation was carried out on a Agilent Eclipse XDBC18 column( 4.6 mm × 250 mm,5 μm) with a mobile phase consisting of acetonitrile (A)-0.2% phosphoric acid solution( B) in a gradient mode at a flow rate of 1 mL/min.Column temperature was 30 ℃,the UV detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid in the first 9.5 min,238 nm for geniposide during 9.5-14.0 min,278 nm for baicalin during 14-30 min.[Result]Excellent chromatographic separation was achieved and the ranges for linear correlation of chlorogenic acid,baicalin and geniposide were 5.01-100.00 μg/mL (r=0.999 7),6.25-100.00 μg/mL (r=0.999 5),10.86-400.00 μg/mL (r=0.999 3),respectively.The sample recovery rates were 98.5%, 100.0%, and 99.0% (n = 6), and the RSD were 0.2%, 0.7%, and 0.4%, respectively.[Conclusion]This method is consistent with the method validation requirements,and can simultaneously determine the above 3 index components of Yinzhi Jiedu granules.The method is simple, accurate and repeatable, and provides a basis for further control of the quality standard of Yinzhi Jiedu granules.

    Key words Yinzhi Jiedu granules;Chlorogenic acid;Baicalin;Geniposide;Content determination;HPLC;Gradient elution;Wavelength shift

    作者簡介 鄭舉(1973—),男,安徽蕭縣人,高級獸醫(yī)師,從事畜禽產(chǎn)品安全、動物防疫工作。*通信作者,高級獸醫(yī)師,碩士,從事中獸藥檢測技術(shù)研究。

    收稿日期 2020-03-13;修回日期 2020-04-15

    茵梔解毒顆粒由茵陳、梔子、虎杖、黃芩、鉤藤5味中藥組成,該藥物具有清熱解毒、疏肝解痙之功效,獸醫(yī)臨床用于雛鴨病毒性肝炎[1-5]。茵梔解毒顆粒為《獸藥質(zhì)量標準》2017年版(中藥卷)收錄的中藥制劑,但只測定其中綠原酸的含量,對其他成分未有規(guī)定,不利于整體控制藥品的質(zhì)量。該試驗在相關文獻的基礎上[6-16],以其中3種藥材的代表性成分為檢測指標,建立了同一流動相條件下同時測定茵梔解毒顆粒中茵陳、梔子、黃芩的3個特征性成分綠原酸、梔子苷、黃芩苷成分含量的HPLC法,既提高了制劑的質(zhì)量控制,又簡化了日常操作,為完善其質(zhì)量標準提供了參考依據(jù),對于該藥標準的修訂具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    Agilent1100型高效液相色譜儀(四元梯度泵/G1311A,自動進樣器/G1379A,真空在線脫氣機,G1315DAD檢測器),美國Agilent公司;EX125DZH十萬分之一分析天平(奧豪斯儀器有限公司);Sartorius BP211D萬分之一分析天平(德國賽多利斯);水由實驗室MILLI-Q超純水自制; SK7200HP型超聲波清洗器(上??茖В?手動移液器(Eppendorf,德國);0.45 μm混合濾膜(美國Waters公司)。

    1.2 試藥

    甲醇、乙腈(Thermo Fisher Scientific公司)為色譜純,其余試劑為分析純,超純水、蒸餾水為自制。茵梔解毒顆粒由安徽省某獸藥有限公司提供(批號 20190811、20190712、20190919、20191010、20191101)。對照品綠原酸(批號 Z0261702,規(guī)格 98.3%)購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,梔子苷(批號110749-201617,規(guī)格98.4%)、黃芩苷(批號110715-201720,規(guī)格 93.52%)購于中國食品藥品檢定研究院。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件。

    采用 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為乙腈(A)~ 0.2% 磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~5 min,13%A;5~10 min,13%A~30%A;10~15 min,30%A~85%A;15~25 min,85%A;25~26 min,85%A~13%A;26~30 min,13%A),流 速1 mL/min,檢測波長327 nm(0~9.5 min,測定綠原酸)、238 nm(9.5~14.0 min,測定梔子苷)、278 nm(14~30 min,測定黃芩苷),柱溫 30 ℃,進樣量 10 μL。在上述色譜條件下,各待測組分分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)均大于6 000。在此條件下,色譜圖及光譜圖如圖1~4所示。

    1.3.2 對照品儲備液的制備。

    精密稱取綠原酸、梔子苷、黃芩苷的對照品適量,分別置于10 mL容量瓶中,用50%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度為綠原酸 1.0 mg/mL、梔子苷1.0 mg/mL、黃芩苷0.1 mg/mL的溶液。作為對照品儲備液。

    1.3.3 混合對照品溶液的制備。

    精密吸取綠原酸對照品儲備液250 μL、梔子苷對照品儲備液 500 μL、黃芩苷對照品儲備液 2 mL,置于10 mL棕色容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,得濃度為綠原酸 25.86 μg/mL、梔子苷50.15 μg/mL、黃芩苷 200.18 μg/mL 的混合對照品溶液,冷藏,備用。

    1.3.4 供試品溶液的制備。

    將茵梔解毒顆粒研細,過40目篩,精密稱取3.0 g,置于50 mL錐形瓶中,精密加入體積分數(shù)為50%甲醇50 mL,稱量,超聲提?。üβ?00 W,頻率40 kHz),提取10 min,放冷再稱量,加體積分數(shù)為50%甲醇水溶液補足減失的量,加500 μL冰醋酸,取適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液上機分析。

    1.3.5 陰性樣品溶液的制備。按處方分別制備缺少茵陳、梔子和黃芩的陰性對照溶液。按“1.3.4”供試品溶液的制備方法進行制備,即得3種陰性樣品溶液。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 專屬性試驗

    混合對照品溶液、供試品溶液及缺茵陳、缺梔子、缺黃芩的3種陰性對照溶液各10 μL,在“1.3.1”色譜條件下分別注入色譜儀,進行分析,根據(jù)色譜圖的出峰時間,得出茵梔解毒顆粒在與綠原酸、梔子苷、黃芩苷對照品相應的位置上,均有相同保留時間的色譜峰,而缺茵陳的陰性對照溶液無綠原酸色譜峰,缺梔子的陰性對照溶液中無梔子苷色譜峰,缺黃芩的陰性對照溶液無黃芩苷色譜峰,說明茵梔解毒顆粒中其他成分對這3個成分的檢測不產(chǎn)生干擾,方法的專屬性好。同時依據(jù)DAD檢測器的峰純度檢測功能,得出3種成分的純度角度小于純度閾值,說明樣品的成分得到良好的分離。

    2.2 線性關系考察

    分別精密量取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL,置5 mL容量瓶中,用體積分數(shù)為50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,按照“1.3.1”色譜條件進行測定。以峰面積(Y)為縱坐標、對照品溶液的質(zhì)量濃度(X,μg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線并進行回歸分析計算,結(jié)果見表 1。 從表1可以看出,綠原酸、梔子苷、黃芩苷在定量測定范圍內(nèi)線性關系良好。

    2.3 精密度試驗

    取同一混合對照品溶液,按“1.3.1”色譜條件連續(xù)進樣6次測定,記錄峰面積。計算得出綠原酸、梔子苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為 0.8%、1.1%、0.6%,均符合要求,表明儀器精密度良好。

    2.4 穩(wěn)定性試驗

    取同一供試品溶液10 μL,室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h,按“1.3.1”色譜條件下進樣分析,記錄峰面積。計算得出綠原酸、梔子苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為0.5%、0.3%、0.4%,表明供試品溶液室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

    2.5 重復性試驗

    精密稱取茵梔解毒顆粒(批號20190811)的樣品6份,每份3.0 g,按“1.3.4”方法制得供試品溶液,按“1.3.1”色譜條件進樣分析,按外標法計算各組分含量及其RSD。測得綠原酸、梔子苷、黃芩苷的含量平均值分別為0.358、0.701、3.156 mg/g,RSD分別為 0.8%、0.6%、0.7%(n=6),表明該方法的重復性良好。

    2.6 加樣回收率試驗

    取已知含量的茵梔解毒顆粒(批號20190811)粉末6份,每份約2.0 g,精密稱定,精密加入已知濃度的綠原酸、梔子苷、黃芩苷對照品的混合溶液2 mL,按“1.3.4”方法制成供試品溶液,按“1.3.1”色譜條件進樣分析,結(jié)果見表2。從表2可以看出,綠原酸、梔子苷、黃芩苷的平均加樣回收率及RSD均符合要求。

    2.7 含量測定

    精密稱取茵梔解毒顆粒5份,按“1.3.4”方法制成供試品溶液,分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL,按“1.3.1”色譜條件進樣分析,外標法進行含量測定。結(jié)果見表3。

    3 討論

    3.1 提取條件的選擇

    利用單因素考察法,對提取方法、提取溶劑、提取時間3個因素進行了考察。在提取溶劑濃度的選擇上,比較了濃度25%、50%、75%、100%的甲醇對各組分的提取效果,試驗結(jié)果顯示,50%甲醇提取茵梔解毒顆粒中的3種成分含量最高。在提取方法上分別選擇超聲、回流2種提取方法,結(jié)果顯示超聲提取效率最高,且簡便快捷。與此同時在超聲提取時間上分別比較了5、10、15、20、30 min對茵梔解毒顆粒的提取效果,試驗結(jié)果顯示,樣品在超聲 10 min 提取效率達到最高。最終選擇的提取方法是用50%甲醇超聲提取10 min。

    3.2 檢測波長的選擇

    同一物質(zhì)在不同檢測波長下具有不同的響應值。在該試驗中利用DAD(光電二極管陣列檢測器)對這3種化合物進行190~400 nm掃描,根據(jù)綠原酸、梔子苷、黃芩苷的特征光譜圖,確定這3種物質(zhì)的最大吸收波長,同時結(jié)合流動相的梯度洗脫的特性,可以將復雜基質(zhì)的成分進行分離,最終確定為 0~9.5 min 時327 nm測定綠原酸,9.5~14.0 min 時238 nm測定梔子苷,14~30 min 時 278 nm測定黃芩苷。

    3.3 流動相的選擇

    該試驗考察了多種流動相體系,首先以甲醇-水(13∶87)、甲醇-磷酸-水(30∶0.1∶70)作為流動相,進行等度、梯度洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸和梔子苷的分離效果不太好,又考察了乙腈-磷酸-水、等度和梯度,發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫時3種化合物得到的色譜峰符合分離要求,最后篩選出乙腈和磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫。經(jīng)試驗驗證,該流動相體系基線平穩(wěn)、無拖尾現(xiàn)象,3種成分色譜峰分離度達到要求,符合系統(tǒng)適用性的要求。故以此為該檢測方法的流動性。

    3.4 耐用性考察

    根據(jù)“1.3.1”色譜條件,分別考察了4款不同品牌的色譜柱Phenomenex Luna C18(4.6 mm×200 mm,5 μm)、Waters Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Aglient Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和Thermo HyPurity C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),設定了3個柱溫(25、35、40 ℃)、3個流速(0.8、1.0、1.2 mL/min),結(jié)果表明上述條件下各組分的分離度和理論塔板數(shù)均能達到要求,證明該方法耐用性較好。

    4 小結(jié)

    該試驗建立了HPLC-DAD波長切換法同時測定茵梔解毒顆粒中綠原酸、梔子苷、黃芩苷的方法,保證各成分在最大吸收波長處檢測,且僅使用1個色譜條件即可實現(xiàn)多個指標成分的質(zhì)量分析。方法學驗證結(jié)果符合《中國獸藥典》2015年版中質(zhì)量分析方法驗證指導原則的要求。該方法的供試品溶液制備簡便快捷,所建立的梯度洗脫方法分離度好,測定結(jié)果準確、重復性好、實用性強,有利于茵梔解毒顆粒整體質(zhì)量的控制。

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