重癥肌無力患者血清胱抑素C水平與臨床特征的相關性研究

黃曉曦，劉 舉，李 慧，李立恒，高鑫鑫，劉洪波

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，抗乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)抗體的產(chǎn)生是臨床上最常見的導致MG的病因，可導致波動性不耐疲勞和骨骼肌無力[1，2]。雖然自身免疫性抗體的產(chǎn)生通常被認為是MG發(fā)病的直接因素，但研究表明細胞免疫及多種細胞因子同樣在發(fā)病中扮演著重要角色。胱抑素C(Cystain C，Cys C)是一種半胱氨酸蛋白酶(cathepsins，Cat)抑制劑，也稱半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，由于其生成速度恒定，受飲食、年齡、性別等影響較小，臨床上最常應用于腎功能的檢測[3]，但一直以來，它在免疫調節(jié)方面廣泛的生物學作用同樣備受關注。近年來，Cys C在自身免疫性疾病，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorder，NMOSD)等疾病中的作用逐漸被人所認識[4]，但迄今為止還沒有關于重癥肌無力患者血清Cys C水平變化的研究，本研究通過分析MG組和對照組人群血清Cys C水平的差異及MG患者血清Cys C水平與Osserman臨床分型、QMG評分、AChR抗體滴度的關系，從而探討Cys C在重癥肌無力疾病發(fā)生發(fā)展中的免疫作用，為關于MG疾病機制和免疫學治療的研究提供新的思路。

1 對象和方法

1.1 對象 回顧性收集2018年6月至2019年8月就診于我院并且有空腹血清Cys C檢測結果的70例急性期MG患者及42例健康體檢者或無器質性疾病的神經(jīng)官能癥患者的臨床資料。所有入組對象均有空腹血清Cys C、腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)、肌酐化驗結果，MG患者均有胸部增強CT和AChR抗體監(jiān)測結果。MG組和對照組臨床特征詳見表1。納入標準：伴或不伴有胸腺瘤的臨床確診MG的患者；排除標準：存在其他病因相關的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征；伴發(fā)血液疾病、甲狀腺功能異常、肝腎功能障礙和除胸腺瘤之外其他部位腫瘤的患者。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)功能缺損評分 詳細采集病史及體格檢查，采用定量重癥肌無力(Quantitative myasthenia gravis，QMG)評分評價MG組患者的神經(jīng)功能缺損程度。

2 結 果

2.1 臨床特點 MG組患者根據(jù)是否合并胸腺瘤分為2組，其中合并胸腺瘤者32例，胸腺瘤主要根據(jù)影像學結果診斷，其中21例患者有術中病理活檢結果證實；胸腺正?；蛟谠缒暌亚谐?8例。所有MG患者采用改良Osserman臨床分型分為眼肌型組(I型)和全身型組(II-V型)，其中眼肌型患者25例，全身型患者45例；AChR抗體陽性者56例，陰性者14例；另選擇作者醫(yī)院同一時期健康體檢者42例作為對照組。MG組所有患者均常規(guī)行空腹血清Cys C檢測、AChR抗體水平監(jiān)測、胸腺增強CT掃描，采用Osserman分型方法分型，根據(jù)QMG評分對其神經(jīng)功能缺損程度進行評價。經(jīng)比較，合并及不合并胸腺瘤的MG組及對照組人員性別、年齡、血清GFR及肌酐水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表1)。

表1 MG組和對照組臨床資料比較

2.2 血清Cys C水平比較 Kruskal-Wallis方法分析結果顯示3組人員血清Cys C水平有顯著差異(H=21.34，P=0.000)。經(jīng)Bonferroni法進行兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，未合并胸腺瘤MG組患者血清Cys C水平顯著高于對照組[(0.900±0.238，0.776±0.123)mg/L，P=0.022]，合并胸腺瘤MG組患者血清Cys C水平顯著高于對照組[(0.998±0.235，0.776±0.123)mg/L，P=0.000]，未合并胸腺瘤MG組和合并胸腺瘤MG組患者的血清Cys C水平無明顯差異[(0.900±0.238，0.998±0.235)mg/L，P=0.131](見圖1A)。

2.3 MG組患者血清與QMG評分及臨床分型的關系 Pearson相關分析結果顯示MG組患者血清CysC水平與QMG評分呈正相關(r=0.482，P=<0.0001)(見圖1B)，但眼肌型與全身型MG患者血清Cys C水平無統(tǒng)計學差異(t=0.366，P=0.716)(見圖1C)。

2.4 MG組患者血清CysC水平與AChR抗體水平的關系 Pearson相關分析結果顯示MG組患者血清CysC水平與AChR抗體水平無明顯相關性(r=0.008，P=0.457)(見圖1D)。

A：各組血清Cys C水平比較 Bonferroni法進行組間兩兩比較，結果顯示無論是否合并胸腺瘤，MG患者血清Cys C水平均高于對照組，且兩組MG患者的血清Cys C水平無明顯差異；B：MG組患者血清Cys C水平與臨床QMG評分的關系；C：眼肌型和全身型MG患者血清Cys C水平比較；D：MG組患者血清Cys C水平與AChR抗體水平的關系。MG 重癥肌無力；GFR 腎小球濾過率；Cys C 胱抑素C；QMG：定量重癥肌無力評分

3 討 論

重癥肌無力是一種罕見、以神經(jīng)肌肉傳遞障礙為特征的自身免疫性疾病。在血清AChR抗體為陽性的MG患者中，患者骨骼肌細胞突觸后膜的AChR抗體與自身免疫性抗體特異性結合，使乙酰膽堿無法正常行使信息傳遞的作用，從而導致骨骼肌不耐疲勞。雖然MG的發(fā)生與體液免疫緊密相關，但T細胞、巨噬細胞等細胞及干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)4、IL-5、IL-10、IL-17等細胞因子均被證明與MG的發(fā)病相關[5]。胱抑素C可通過直接或間接的方式調節(jié)T細胞的增殖、分化及其相關分子的表達，近年來被發(fā)現(xiàn)參與多種自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展。迄今為止，CysC被發(fā)現(xiàn)與MS、NMOSD、甲狀腺功能亢進(hyperthyroidism)、格林巴利綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種疾病相關[6～9]，但目前還沒有關于MG患者血清Cys C水平變化的研究。本文旨在通過回顧性分析，探討Cys C在MG疾病發(fā)生發(fā)展中的免疫作用。

Cys C的編碼基因位于20號染色體短臂，屬于“管家基因”，能以恒定速度表達于幾乎全部的有核細胞中，廣泛存在于外周血、腦脊液、尿液等多處體液，血清濃度受飲食、性別、年齡、肌肉質量、藥物等因素影響較小，腎臟是其唯一代謝途徑[10，11]。Cys C對髓鞘基質蛋白有降解作用，導致Cys C水平在MS、NMOSD、GBS患者體液，尤其是腦脊液中因過度消耗而呈現(xiàn)下降趨勢，而在SLE、甲狀腺功能亢進患者血液中則由于其主要通過對Cat的調節(jié)機制發(fā)揮作用，而表現(xiàn)為升高趨勢。雖然外周血Cys C水平在類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者中呈下降趨勢，但它和Cat B在RA患者滑膜組織中被檢測到高表達[12]。除了自身免疫性疾病，Cys C水平異常還可作為骨髓瘤、乳腺癌、結腸癌、非霍奇金b細胞淋巴瘤以及腎細胞癌的診斷和預后指標，血清Cys C升高明顯多與預后不良相關[13～18]。

本研究旨在觀察探討急性期MG患者血清Cys C的水平變化及其與臨床特征的關系，目前尚未發(fā)現(xiàn)國內外有類似研究。在本研究中，兩組病例組和對照組的肌酐、GFR無統(tǒng)計學差異，排除了腎功能對Cys C的影響。本研究結果顯示，未合并胸腺瘤MG組和合并胸腺瘤MG組血清Cys C水平均顯著高于對照組[(0.900±0.238，0.998±0.235，0.776±0.123)mg/L，P=0.000]。血清Cys C水平與臨床QMG評分呈正相關(r=0.482，P<0.0001)，但與Osserman分型、AChR抗體滴度無明顯相關(P>0.05)。合并與不合并胸腺瘤的兩個亞組MG患者的外周血Cys C水平無統(tǒng)計學差異，表明胸腺并非影響MG患者血清Cys C水平的因素。

Cys C在自身免疫性疾病中的作用機制通常被認為與其靶酶的作用有關。Cat是溶酶體內的一種蛋白水解酶，在蛋白質轉換、調節(jié)先天免疫細胞吞噬、主要組織相容性復合體- II(MHC-II)介導的抗原表達及凋亡等多個生物過程中起到重要作用[19，20]。它們可以控制溶酶體的生物發(fā)生和自噬通量，從而影響先天免疫細胞的生存和極化，還可調節(jié)細胞外部和細胞骨架之間的雙向通信，從而影響細胞相互作用、形態(tài)和運動。Cat通過控制抗原遞呈，促進適應性免疫細胞的啟動，并參與細胞毒性顆粒介導的殺傷細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的功能活動。它的異常活性可以通過其內源性抑制劑——半胱氨酸蛋白酶抑制劑來預防[18]。作為Cat抑制劑之一，越來越多的證據(jù)表明Cys C在病理情況下如果控制不當，最終會導致炎性自身免疫性疾病或腫瘤的發(fā)展[21]。Cys C受復雜的炎癥因子調節(jié)，同時也反過來影響炎癥及其介導的免疫反應。然而，雖然其免疫調節(jié)功能和它對Cat的調控作用息息相關，但它重癥肌無力的發(fā)病中的作用還可能涉及其他機制。

如前所述，MG的發(fā)病與B細胞、T細胞、巨噬細胞等及多種細胞因子均相關。在實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠肌肉組織內存在大量巨噬細胞的浸潤[22]。動物實驗證實Th1細胞與巨噬細胞等分泌的IFY-γ、TNF-α等細胞因子與AChR抗體的產(chǎn)生及表達水平的升高相有關[23，24]，而Th2細胞分泌的IL-4可能對抗AChR抗體免疫具有保護作用[25]。Cys C則與IFN-γ、TNF-α信號轉導通路、T細胞的分化等均有關，并可通過直接或間接的方式調節(jié)T細胞的增殖、分化及其相關分子的表達[26～28]。結合本次實驗結果，我們推測因MG患者體內存在免疫環(huán)境的紊亂，B細胞、T細胞、巨噬細胞、IFN-γ等免疫細胞和細胞因子的免疫平衡被打破，一方面，Cat的表達發(fā)生變化，使Cys C含量隨之改變，調控Cat的生物學活動，另一方面直接受紊亂的免疫細胞和細胞因子的作用，促進Th2樣細胞向Th1樣細胞的分化，并增強IFN-γ等細胞因子的促炎作用，這些復雜的機制最終表現(xiàn)為血清Cys C水平的升高，并與MG患者的病情嚴重程度表現(xiàn)出一定的相關性。研究結果顯示血清Cys C與MG患者Osserman臨床分型無關但與QMG評分呈正相關關系，提示血清Cys C或可作為病情嚴重程度或疾病活動的標志。

本研究尚存在不足之處。首先，本研究納入的患者均為急性期MG患者，缺乏緩解期的對照；其次，如果我們能夠將抗骨骼肌特異性酪氨酸激酶型MG(Musk-MG)等類型患者一并納入，并將MG患者急性期、緩解期的血清Cys C水平與對照組進行比較，結論將更加全面和具有說服力。除此之外，受條件所限，本研究也缺乏對預后的分析。但我們的工作擴充了對Cys C在神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中作用的研究，也為Cys C在自身免疫紊亂中扮演重要角色這一結論提供了MG疾病方面的證據(jù)，對進一步了解Cys C在免疫紊亂中的作用、認識MG發(fā)病后的免疫紊亂表現(xiàn)及進行有針對性的免疫治療等方面具有一定的啟發(fā)意義。