埃及伊蚊不同組織的基因共表達模式分析

劉 杰,李 勃,陳曉潔,陳 斌

(重慶師范大學昆蟲與分子生物學研究所,媒介昆蟲重慶市重點實驗室,重慶 401331)

截至2017年，全球已知蚊蟲約3 573種，其中我國約有419種(付文博和陳斌,2018)。它們分布廣，繁殖快。絕大多數(shù)種類的雌蚊需要吸食血液作為補充營養(yǎng)以使卵正常發(fā)育。因其吸血行為，蚊蟲傳播許多危險的人類疾病的病原體，是多種惡性傳染病的傳播媒介(Tolle,2009)。蚊媒病是人類健康的主要威脅，每年全球有7億人受感染，造成70多萬人死亡。近年來，登革熱發(fā)病率大幅度增長，全球約有一半人口面臨登革熱的威脅(WHO,2019)(https:∥www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue)。埃及伊蚊Aedesaegypti(Linnaeus,1762)是登革熱病毒的主要傳播媒介，同時也攜帶基孔肯雅熱、黃熱病以及寨卡病毒病等傳染病病原。這些疾病每年在全世界造成數(shù)億人感染，導致數(shù)萬人死亡，并呈逐年上升趨勢(Akbarietal.,2013)。媒介蚊蟲的控制是蚊媒病控制的關鍵，已成為當今社會所面臨的亟待解決的重大問題之一。蚊蟲的不同組織承擔不同的生理功能，掌握它們的基因表達差異有利于認知它們的生物學功能。蚊蟲的遺傳控制是蚊蟲潛在的重要控制措施之一，弄清蚊蟲不同組織在行使功能過程中的共表達基因以及起重要作用的核心(hub)基因有利于尋找遺傳控制的靶標基因。

轉(zhuǎn)錄組是特定細胞或組織在特定時間或狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合(Wangetal.,2010)，通過對轉(zhuǎn)錄組的研究可以揭示蚊蟲組織分化過程中的基因表達模式和結構變異，并發(fā)現(xiàn)新基因等。近年來，隨著microarray和RNA-Seq等高通量技術的飛速發(fā)展與成本的降低，產(chǎn)生了大規(guī)模蚊蟲組織轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)(Martínez-Barnetcheetal.,2012;Matthewsetal.,2016;Chenetal.,2017)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組學研究主要是在兩類樣本相互比較的基礎上，鑒定差異表達基因，進而對差異基因進行注釋與富集分析，并挖掘這些基因的功能表現(xiàn)和參與的通路(pathway)，從而解析相關的生物學問題或分子機制。但這樣的研究策略主要局限于對組間差異表達的基因進行研究，容易忽略掉基因之間的協(xié)同表達或表達互作。目前，基于全局的權重基因共表達網(wǎng)絡分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)正好為這個問題的解決帶來了契機。WGCNA分析基于大樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)基因表達水平的不同將基因聚類，具有相似表達模式的基因會被劃分到同一個模塊，同一模塊中的基因常具有相似的生物學功能(楊宇昕等,2019)。作為一種系統(tǒng)生物學分析方法，WGCNA可以用來鑒定高度協(xié)同變化的基因集、挖掘與目標組織或性狀相關的特異性模塊，并可進一步研究模塊內(nèi)基因的互作關系，以及篩選hub基因(Langfelder and Horvath,2008)，且在描述解析復雜表型下的分子作用機制和網(wǎng)絡關系等方面具有獨特優(yōu)勢。自WGCNA方法和軟件包開發(fā)以來，它已廣泛應用于多個研究領域，并取得了一系列的研究成果(Greenhametal.,2017;Liuetal.,2018;Dengetal.,2019)。

在蚊蟲轉(zhuǎn)錄組研究領域，Hickner等(2015)用WGCNA方法研究了尖音庫蚊Culexpipiens滯育誘導的潛在調(diào)控機制，構建了包含5個模塊的基因共表達網(wǎng)絡，通過對網(wǎng)絡模塊中基因的富集分析，鑒定出了與滯育誘導相關的多個基因集；通過對埃及伊蚊環(huán)境驅(qū)動變異介導的模塊化基因網(wǎng)絡研究，Kang等(2018)揭示了先天免疫反應的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和關鍵基因。這些研究表明，將轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)與WGCNA方法相結合，可為探索蚊蟲生物學過程相關分子機制提供強有力的工具。然而，尚未有基于WGCNA方法對蚊蟲不同組織基因共表達模式的研究。

蚊蟲的不同組織在其傳播疾病過程中起著重要的作用，可作為防控的靶標。本研究利用WGCNA方法，結合RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構建了埃及伊蚊9種組織加權基因共表達網(wǎng)絡，挖掘出與組織特異性相關的共表達模塊，研究模塊基因功能，并篩選出在組織特異性模塊內(nèi)起重要作用的hub基因，揭示基因間的相互作用關系，旨在為探究蚊蟲不同組織特有的基因資源信息，進而解析基因功能與組織功能的聯(lián)系，篩選遺傳控制的靶標基因提供新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

埃及伊蚊不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于NCBI(National Center for Biotechnology Information)的SRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫，獲取碼為PRJNA236239(Matthewsetal.,2016)。選擇其中未吸血狀態(tài)下雌蚊和雄蚊9種組織的雙端測序數(shù)據(jù)進行分析，包括雌蚊的觸角、腦、喙、下顎須、卵巢，以及雄蚊的觸角、腦、前足、中足、后足和腹部末端(被定義為雄蚊包括生殖器在內(nèi)的3個末端腹節(jié))等。不同組織數(shù)據(jù)包含的生物學重復次數(shù)為：雌蚊喙5次生物學重復，觸角、下顎須4次重復，卵巢3次重復，腦2次重復，雄蚊各組織均3次重復，總計36個樣本。WGCNA分析根據(jù)基因表達水平的不同將基因聚類。在轉(zhuǎn)錄組研究中，可通過比對到基因組區(qū)域或基因外顯子區(qū)的測序序列(reads)計數(shù)(read counts)來估計基因的表達水平。但reads計數(shù)除了與基因的真實表達水平成正比外，還與基因的長度和測序深度成正相關，因此使得不同基因的表達水平不具有可比性。為了解決這個問題，人們引入了FPKM(fragments per kilobase million)、RPKM(reads per kilobase million)和TPM(transcripts per million)的概念。其中TPM是每百萬條reads的轉(zhuǎn)錄本，其同時考慮了測序深度和基因長度對reads計數(shù)的影響，是目前常用的衡量基因表達水平的方法之一。本研究中埃及伊蚊不同組織基因的TPM值采用Matthews等(2016)文獻中Additional File 6中的結果。

1.2 基因共表達網(wǎng)絡構建

采用TPM值作為標準化的基因表達水平定量，本研究共納入36個樣本。在應用WGCNA前，基于公式log2(TPM+1)對數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)換(趙志洪,2017)。經(jīng)過缺失值移除以及方差計算后，篩選出方差最大的5 000個基因，使用R(v.3.6.1)軟件中(https:∥cran.r-project.org/bin/windows/base/old/)的WGCNA(v.1.67)包來構建加權基因共表達網(wǎng)絡并劃分模塊。首先利用函數(shù)pickSoftThreshold(Langfelder and Horvath,2008)計算權重值，通過選擇合適的權重值，使網(wǎng)絡符合無尺度網(wǎng)絡分布。

根據(jù)上一步分析結果，選擇最優(yōu)的軟閾值。使用自動網(wǎng)絡構建函數(shù)blockwiseModules(Langfelder and Horvath,2008)構建共表達網(wǎng)絡，除參數(shù)minModuleSize=50外，其余參數(shù)按照默認設置。

1.3 基因表達組織特異性模塊鑒定

一組表達模式高度相似的基因常聚集在同一模塊，而具有相似表達模式的基因被認為具有類似的生物學功能(楊宇昕等,2019)。一般而言，如果某模塊與樣品的某種特定表型的相關性顯著高于其他模塊，說明這一個模塊可能與該表型存在強的關聯(lián)，為特異性模塊。本研究由于只有埃及伊蚊不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并沒有其他表型數(shù)據(jù)，在此直接將不同組織作為研究的表型性狀，以分析模塊與組織的聯(lián)系。首先建立一個行為36個組織樣本，列為11個不同取樣組織名稱的矩陣，若行與列為同一組織，即為1，不是同一組織即為0。計算每個模塊特征向量基因(module eigengene,ME)和這個矩陣之間的相關系數(shù)，該數(shù)值越接近1，表示模塊與樣品表型的正相關性越強；越接近-1，表示模塊與樣品表型負相關性越強。本研究中模塊與組織高度正相關的篩選標準為：模塊與組織相關系數(shù)大于0.65，且統(tǒng)計顯著性P<0.05。選擇與組織高度正相關的模塊，作為組織特異性模塊進行后續(xù)分析(Downsetal.,2013)。

1.4 組織特異性模塊基因的GO和KEGG富集分析

首先，使用Bioconductor中的AnnotationHub(v.2.18.0)包獲取埃及伊蚊的注釋信息，下載埃及伊蚊OrgDb數(shù)據(jù)庫(AH76482,v.2.1)中的注釋數(shù)據(jù)，再利用Bioconductor中的clusterProfiler(v.3.14.3)包對模塊內(nèi)基因進行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析(Yuetal.,2012)。一般情況下，P<0.01，q<0.05，則為富集功能項或通路。

1.5 模塊基因互作網(wǎng)絡構建篩選hub基因

導出WGCNA共表達網(wǎng)絡分析結果到Cytoscape(v.3.7.1)軟件(Suetal.,2014)中，對基因調(diào)控網(wǎng)絡進行可視化。通過CytoHubba插件的12種算法，得到連接度在前10的基因，選擇在不同算法中重復出現(xiàn)次數(shù)大于5的基因，在本研究中被定義為hub基因。

2 結果

2.1 權重基因共表達網(wǎng)絡構建

根據(jù)基因表達水平對樣本進行聚類。如圖1所示，基于平均(average)距離和層次聚類算法聚類結果表明，基因表達模式除了在雄成蚊前足和中足中出現(xiàn)了一定的散亂之外，測序所用的埃及伊蚊成蚊組織大多具有很高的重復性。雌/雄成蚊的觸角、腦中基因表達模式相近，聚類在一起；雄成蚊前足、中足及后足中基因表達模式相近，聚類在一起；雌成蚊喙與下顎須中基因表達模式相近，聚類在一起。對軟閾值(β)進行篩選，最終選取β值為12。通過WGCNA方法成功構建埃及伊蚊成蚊不同組織加權基因共表達網(wǎng)絡，并將網(wǎng)絡劃分為11個模塊(圖2:A)。圖2(A)上半部分的聚類樹中每個枝代表一個模塊，每個枝上的葉代表一個基因，圖2(A)下半部分的模塊顏色中每個顏色代表一個模塊。共表達模塊中基因的具體數(shù)量如圖2(B)所示。模塊中基因個數(shù)123～1 423不等，共含有5 000個基因。其中turquoise模塊包含的基因數(shù)目最多，達1 423；greenyellow模塊內(nèi)的基因數(shù)量最少，為123；grey表示未劃分到模塊中的基因，圖2(A)中grey模塊基本不可見，因未劃分到模塊的基因僅有7個。

圖1 基于基因表達水平的埃及伊蚊成蚊不同組織聚類Fig.1 Clustering of different adult tissues of Aedes aegypti based on gene expression levelsFe_Ov:雌蚊卵巢Female ovary;Ma_Br:雄蚊腦Male brain;Fe_Br:雌蚊腦Female brain;Ma_An:雄蚊觸角Male antenna;Fe_An:雌蚊觸角Female antenna;Ma_At:雄蚊腹部末端Male abdominal tip;Ma_HL:雄蚊后足Male hindleg;Ma_FL:雄蚊前足Male foreleg;Ma_ML:雄蚊中足Male midleg;Fe_Os:雌蚊喙Female proboscis;Fe_Pa:雌蚊下顎須Female maxillary palp。根據(jù)基因表達水平，采用平均距離和層次聚類算法對樣本進行聚類。橫軸表示埃及伊蚊成蚊不同組織，代號末位的數(shù)字表示該組織的重復樣本；縱軸代表基因間的聚類高度。According to gene expression level,average distance and hierarchical clustering algorithm were used to cluster the samples.The abscissa represents the different adult tissues of A.aegypti,the last digit of the code represents a duplicate sample of the tissue,and the ordinate represents the cluster height of genes.

圖2 埃及伊蚊成蚊不同組織基因共表達模塊Fig.2 Gene co-expression modules in different adult tissues of Aedes aegyptiA:基因聚類數(shù)和模塊分割。上半部分表示基因聚類所得聚類樹，縱坐標代表各基因間的聚類距離；下半部分表示按樹的分枝切割得到的模塊，相同模塊用同一顏色表示。Clustering dendrogram of genes and module splitting.The upper part represents dendrogram tree obtained by gene hierarchical clustering,and the ordinate represents the clustering distance between genes.The lower half represents the module cut by the branches of the tree,and the same module is represented by the same color.B:共表達模塊中基因數(shù)量分布。橫坐標代表模塊，縱坐標代表模塊中的基因數(shù)目，不同的顏色與模塊名稱對應，每個柱子上的數(shù)字表示該模塊內(nèi)的基因數(shù)目。Distribution of gene number.The abscissa represents the module,and the ordinate represents the number of genes in the module.Different colors correspond to the module name.The number on each column represents the number of genes in the module.

2.2 組織特異性模塊分析結果

通過篩選發(fā)現(xiàn)在11個模塊中有6個為高度的組織特異性模塊(r>0.65,P<0.05)(圖3)。在雌成蚊觸角、喙、卵巢、下顎須以及雄成蚊腦和腹部末端組織中各鑒定出1個特異性模塊。green模塊與雌成蚊觸角存在高度相關性(r=0.69,P=4E-06)，purple模塊與雌成蚊喙存在高度相關性(r=0.8,P=4E-09)，turquoise模塊與雌成蚊卵巢存在高度正相關性(r=0.96,P=4E-20)，red模塊與雌成蚊下顎須存在高度正相關性(r=0.69,P=4E-06)。與雄成蚊腦高度正相關的模塊為blue模塊(r=0.7,P=2E-06)，與雄成蚊腹部末端高度正相關的模塊為magenta模塊(r=0.96,P=2E-37)。6個組織特異性模塊中沒有任何一個模塊和雄成蚊前足、中足、后足存在較高相關性。推測可能是這3個組織中的基因主要進行基本的生命活動，因此沒有特異性的模塊與之對應。

圖3 埃及伊蚊成蚊不同組織基因共表達模塊與性狀關聯(lián)熱圖Fig.3 Heat map of module-trait relationship of different adult tissues in Aedes aegyptiFe_An:雌蚊觸角Female antenna;Fe_Br:雌蚊腦Female brain;Fe_Os:雌蚊喙Female proboscis;Fe_Ov:雌蚊卵巢Female ovary;Fe_Pa:雌蚊下顎須Female maxillary palp；Ma_An:雄蚊觸角Male antenna;Ma_At:雄蚊腹部末端Male abdominal tip;Ma_Br:雄蚊腦Male brain;Ma_FL:雄蚊前足Male foreleg;Ma_ML:雄蚊中足Male midleg;Ma_HL:雄蚊后足Male hindleg.MEgreenyellow:黃綠色模塊特征向量基因Module eigengene of green yellow module;MEturquoise:藍綠色模塊特征向量基因Module eigengene of turquoise module;MEmagenta:品紅色模塊特征向量基因Module eigengene of magenta module;MEpurple:紫色模塊特征向量基因Module eigengene of purple module;MEred:紅色模塊特征向量基因Module eigengene of red module;MEblack:黑色模塊特征向量基因Module eigengene of black module;MEbrown:棕色模塊特征向量基因Module eigengene of brown module;MEyellow:黃色模塊特征向量基因Module eigengene of yellow module;MEblue:藍色模塊特征向量基因Module eigengene of blue module;MEgreen:綠色模塊特征向量基因Module eigengene of green module;MEpink:粉紅色模塊特征向量基因Module eigengene of pink module;MEgrey:灰色模塊特征向量基因Module eigengene of grey module.該圖基于R語言所得，橫軸表示埃及伊蚊不同組織，縱軸表示每一個模塊的特征向量。括號內(nèi)數(shù)值表示模塊與組織相關系數(shù)和統(tǒng)計顯著性。相關系數(shù)越接近1，表示模塊與樣品正相關性越強；越接近-1，表示模塊與樣品負相關性越強。Based on the R language,the horizontal axis represents the different tissues of A.aegypti,and the vertical axis represents the module eigengene of each module.The values in parentheses represent the correlation coefficient and statistical significance between the module and the tissues.The closer the correlation coefficient is to 1,the stronger the positive correlation between the module and the sample;the closer to -1,the stronger the negative correlation between the module and the sample.

2.3 組織特異性模塊GO和KEGG富集分析

組織特異性模塊可能參與組織特有的生物學過程，為進一步解析組織特異性模塊內(nèi)基因的生物學功能，并與相應組織功能聯(lián)系，同時也驗證共表達網(wǎng)絡構建和組織特異性模塊的可靠性，對這6個特異性模塊進行GO和KEGG富集分析。GO富集分析結果表明(表1)，與雌成蚊觸角高度正相關的green模塊在纖毛組裝、基于微管運動和細胞對刺激的反應等生物學過程中發(fā)揮主要作用，其主要的細胞組分為微管相關復合物、細胞外圍、質(zhì)膜等，具有氣味結合、嗅覺受體活性、跨膜信號受體活性等生物學功能；與雄成蚊腦高度正相關的blue模塊在生物學過程調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)系統(tǒng)過程等生物學過程中發(fā)揮主要作用，其主要的細胞組分為質(zhì)膜、突觸、突觸后膜等，具有轉(zhuǎn)運活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、鐵離子結合等功能；與雌成蚊喙高度正相關的purple模塊具有絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、絲氨酸水解酶活性等功能；與雌成蚊卵巢高度正相關的turquoise模塊在DNA復制、細胞分裂、細胞周期等生物學過程中發(fā)揮主要作用，其主要的細胞組分為核小體、染色體等，具有DNA結合、鋅離子結合、微管結合、解旋酶活性等功能；與雌蚊下顎須高度正相關的red模塊在有機酸代謝、羧酸代謝、細胞氨基酸代謝等生物學過程中發(fā)揮作用，其細胞組分為細胞外區(qū)域，具有絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、碳水化合物結合等功能；與雄成蚊腹部末端高度正相關的magenta模塊在羧酸代謝、草酸代謝、有機酸代謝等生物學過程中發(fā)揮主要作用。

表1 埃及伊蚊成蚊組織特異性基因共表達模塊的GO富集分析Table 1 GO enrichment analysis of tissue specific gene co-expression module in Aedes aegypti adults

KEGG富集分析結果表明(表2)，與雌成蚊觸角高度正相關的green模塊顯著富集在藥物代謝-細胞色素P450、不飽和脂肪酸的生物合成以及谷胱甘肽代謝等通路；與雄成蚊腦高度正相關的blue模塊顯著富集在刺激神經(jīng)組織中的交互、光傳導以及其他多糖降解通路；與雌成蚊卵巢高度正相關的turquoise模塊顯著富集在DNA復制、錯配修復、戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉(zhuǎn)化等通路；與雌成蚊下顎須高度正相關的red模塊顯著富集在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝通路以及精氨酸和脯氨酸代謝通路；magenta和purple模塊未發(fā)現(xiàn)顯著富集通路。

表2 埃及伊蚊成蚊組織特異性基因共表達模塊的KEGG富集分析Table 2 KEGG enrichment analysis of tissue specific gene co-expression module in Aedes aegypti adults

2.4 組織特異性模塊hub基因識別

整合CytoHubba插件12種不同算法的結果，取重復出現(xiàn)次數(shù)大于5次的基因，共得到47個hub基因(green,blue,purple,turquoise,red和magenta模塊分別有9,5,6,9,9和9個)(表3)。green,blue,purple,turquoise,red和magenta模塊中連通性最高的基因分別為AAEL010426,AAEL002896,AAEL002600,AAEL000961,AAEL007784和AAEL006429。

表3 埃及伊蚊成蚊組織特異性基因共表達模塊內(nèi)的hub基因Table 3 Hub genes within a tissue-specific module in Aedes aegypti adults

基于WGCNA共表達網(wǎng)絡分析結果，對組織特異性模塊內(nèi)連通性最高的核心基因進行可視化展示，因與核心基因互作的基因較多，僅對權重值前50個有關聯(lián)的基因進行可視化(圖4)。結果發(fā)現(xiàn)，green模塊的基因在雌/雄成蚊觸角中高表達，與核心基因AAEL010426具有較高互作網(wǎng)絡關系的基因為AAEL017505,AAEL017129,AAEL017104,AAEL007147和AAEL013563；blue模塊的基因在雌/雄成蚊腦中高表達，與核心基因AAEL002896具有較高互作網(wǎng)絡關系的基因為AAEL012541,AAEL004246,AAEL007559,AAEL003472和AAEL002220；purple模塊的基因在雌成蚊喙中表達最高，與核心基因AAEL002600具有較高互作網(wǎng)絡關系的基因為AAEL014382,AAEL017265,AAEL011610,AAEL013032和AAEL014390；turquoise模塊的基因在雌成蚊卵巢中高表達，與核心基因AAEL000961具有較高互作網(wǎng)絡關系的基因為AAEL000898,AAEL013338,AAEL000923,AAEL007879和AAEL011516；red模塊的基因在雌成蚊下顎須、雄成蚊腹部末端較高表達，與核心基因AAEL007784具有較高互作網(wǎng)絡關系的基因為AAEL000044,AAEL003114,AAEL007033,AAEL002624和AAEL012726；magenta模塊的基因在雄成蚊腹部末端高表達，與核心基因AAEL006429具有較高互作網(wǎng)絡關系的基因為AAEL010040,AAEL006414,AAEL002000,AAEL001550和AAEL005107。

圖4 埃及伊蚊成蚊組織特異性基因共表達模塊內(nèi)連通性最高的核心基因的基因網(wǎng)絡Fig.4 Gene networks of the most interconnected hub gene in the tissue-specific gene co-expression module of Aedes aegypti adults圖中綠色、藍色、紫色、藍綠色、紅色和品紅色線條分別表示green,blue,purple,turquoise,red和magenta模塊。每個網(wǎng)絡圖中位于中心的為該組織特異性基因共表達模塊內(nèi)連通性最高的核心基因，其余帶有顏色標記的基因表示與模塊內(nèi)連通性最高的核心基因具有較高互作網(wǎng)絡關系的前5個基因，顏色越深表示互作關系越強。網(wǎng)絡中只列出與核心基因互作權重值較高的基因。The green,blue,purple,turquoise,red,and magenta lines in the figure represent the green,blue,purple,turquoise,red,and magenta modules,respectively.At the center of each network diagram is the hub gene with the highest connectivity within the tissue-specific gene co-expression module.The remaining genes with color marks represent the top 5 genes with a higher interactive network relationship with the hub genes with the highest connectivity in the module.The darker the color,the stronger the interactive relationship.In the network,only the genes with high weights interacted with the hub genes were listed.

已知AAEL007373和AAEL008046可能參與埃及伊蚊尋找宿主過程中氨的檢測(Matthewsetal.,2016)。基于WGCNA分析結果，發(fā)現(xiàn)AAEL007373被劃分到green模塊，該模塊基因在雌/雄成蚊觸角中高表達；AAEL008046被劃分到blue模塊，該模塊基因在雌/雄成蚊腦中高表達。以這兩個基因為核心構建局部網(wǎng)絡(圖5)，發(fā)現(xiàn)green模塊內(nèi)的基因AAEL007373與離子通道型受體基因AAEL000047、氣味受體基因AAEL015147和AAEL005999等具有較高互作網(wǎng)絡關系；green模塊內(nèi)的核心基因AAEL014089,AAEL007669,AAEL012424,AAEL010426,AAEL001510和AAEL013197也均與其存在互作。blue模塊內(nèi)的基因AAEL008046與AAEL004246,AAEL006825和AAEL000504等存在關聯(lián)；blue模塊內(nèi)的核心基因AAEL002896,AAEL010918和AAEL001696也與其存在互作網(wǎng)絡關系。

圖5 埃及伊蚊AAEL007373和AAEL008046的基因網(wǎng)絡Fig.5 Gene networks of AAEL007373 and AAEL008046 of Aedes aegypti圖中綠色和藍色分別表示green和blue模塊。網(wǎng)絡中只列出與核心基因互作權重值較高的基因。Green and blue colors in the figure represent green and blue modules,respectively.In the network,only the genes with high weights interacted with the hub genes were listed.

3 討論與結論

基因的表達存在相關性，功能相關的一組基因常協(xié)調(diào)一致，共同表達。對蚊蟲不同組織的基因共表達模式進行研究，可獲得組織特有的基因資源信息，得到組織在行使功能過程中的共表達基因以及起重要作用的核心基因，幫助研究者深入理解組織中基因間的相互作用模式，進而解析基因功能與組織生物學功能的聯(lián)系，篩選遺傳控制的靶標基因。在大樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，傳統(tǒng)的差異分析或趨勢分析，僅羅列了單一的基因列表，無法得到基因間的相關性，并對基因進行有效的分類，亦不能推測新的基因相互作用關系。WGCNA分析從系統(tǒng)角度出發(fā)，將協(xié)同變化的基因進行聚類，以網(wǎng)絡模塊的形式呈現(xiàn)基因的共表達特性。其優(yōu)勢在于，將海量的數(shù)據(jù)進行歸納和整理，高效研究基因整體表達規(guī)律，并系統(tǒng)地反饋樣本中基因間的相互作用模式，同時可特異性地篩選出與樣本性狀相關的基因模塊和hub基因。作為一種高效的數(shù)據(jù)挖掘手段，其在多樣本RNA-Seq數(shù)據(jù)的應用中越來越流行(Zhaoetal.,2010;巨飛燕等,2019)。WGCNA分析可為蚊蟲不同組織的基因共表達模式研究提供新思路。

本研究利用WGCNA方法對埃及伊蚊成蚊不同組織的基因共表達模式進行研究，構建了埃及伊蚊9種組織加權基因共表達網(wǎng)絡，結果顯示埃及伊蚊這9種組織涉及11個基因共表達模塊(圖2)；將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對應的不同組織(雌蚊：腦、觸角、喙、下顎須、卵巢；雄蚊：腦、觸角、前足、中足、后足、腹部末端)作為研究的性狀，成功鑒定到與雌蚊觸角、喙、下顎須、卵巢以及雄蚊腦、腹部末端相關的6個組織特異性模塊，分別為green,purple,red,turquoise,blue和magenta模塊(圖2)。蚊蟲分化成熟的多個組織共同支撐其追尋寄主、吸取血液、交配產(chǎn)卵、傳播疾病等生命活動過程。研究表明，蚊蟲可利用多種化學和物理線索，如宿主釋放的氣味、CO2、周圍環(huán)境的化學信號以及雌蚊翅產(chǎn)生的特定頻率等，并據(jù)此定位宿主的位置、選擇配偶和找尋產(chǎn)卵地點(Hartberg,1971;Catoretal.,2009;Matthewsetal.,2016)。觸角、喙和下顎須在此過程中起著極其重要的作用，因此它們被認為是蚊蟲防治控制的重要靶標之一(張晶晶,2019)。其中觸角是蚊蟲最主要的嗅覺器官，在成蚊觸角上有許多被稱為感受器的感覺結構，這是進行化學感知的物理位置(張靜等,2019)；喙是蚊蟲在進食過程中處理味覺代碼的重要頭部附屬物，其作為探針到達宿主皮膚下的血管(Maekawaetal.,2011)。下顎須是蚊蟲主要的化學感覺器官，可感知CO2和揮發(fā)性氣味物質(zhì)等(Grantetal.,1995)。腦是蚊蟲神經(jīng)調(diào)節(jié)的重要場所，也是目前蚊蟲生物防控研究的熱點之一，其內(nèi)含有多種神經(jīng)遞質(zhì)，如乙酰膽堿、GABA以及谷氨酸等(Matthewsetal.,2016)。在腦的高級處理中心可整合嗅覺和其他感覺模式，最終將這些信號轉(zhuǎn)化為行為，其可能是蚊蟲防控的一個新靶標(Riabininaetal.,2016)。而卵巢、腹部末端是與蚊蟲生殖細胞發(fā)育、繁殖相關的重要場所，有研究認為可通過將雌蚊轉(zhuǎn)化為無害的雄蚊的策略而實現(xiàn)蚊蟲防控，提示調(diào)節(jié)蚊蟲性別分化過程可能是當前防控蚊蟲的一個重要突破口(Halletal.,2015)。對6個組織特異性模塊內(nèi)基因的注釋分析發(fā)現(xiàn)，與雌成蚊觸角特異性相關的green模塊具有氣味結合和嗅覺受體活性等功能；與雌成蚊喙特異性相關的purple模塊具有絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性和絲氨酸水解酶活性等功能；與雌成蚊下顎須正相關的red模塊具有絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性和碳水化合物結合等功能；與雄成蚊腦特異性相關的blue模塊在生物學過程調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導、神經(jīng)系統(tǒng)過程等生物學過程中發(fā)揮主要作用；與雌成蚊卵巢特異性相關的turquoise模塊在DNA復制、細胞分裂、細胞周期等生物學過程中發(fā)揮主要作用；與雄成蚊腹部末端特異性相關的magenta模塊在羧酸代謝、草酸代謝、有機酸代謝等生物學過程中發(fā)揮主要作用(表1和2)。其均能與對應組織功能相聯(lián)系，說明組織特異性模塊的識別可靠，可用于后續(xù)相關信息的挖掘。

核心基因在基因表達網(wǎng)絡中具有高的連接度，其往往是重要的作用靶點和研究熱點，在生物學過程中起著關鍵作用。但通過Cytoscape構建基因互作網(wǎng)絡后，較多的node和edge常會掩蓋真正的核心基因，影響篩選過程。因此本研究采用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件，進一步縮小了6個組織特異性模塊中核心基因的搜索范圍，共篩選出47個在模塊內(nèi)可能起重要作用的hub基因(表3)。這些基因大多可在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中找到對應直系同源物。green模塊內(nèi)AAEL005810,AAEL007669,AAEL010214和AAEL013197在黑腹果蠅中的直系同源基因分別為CG14085,Antdh,CCDC151和CG4362；blue模塊內(nèi)hub基因在黑腹果蠅中均有直系同源物；turquoise模塊內(nèi)AAEL008595,AAEL000961和AAEL003226在黑腹果蠅中有直系同源基因，分別為Mael,Clos和Cpr49Aa-Cpr65Az；red模塊內(nèi)AAEL007033,AAEL000311和AAEL013417在黑腹果蠅中直系同源基因分別為P5cr-2,Fon和CG30280；magenta模塊內(nèi)AAEL006427,AAEL006429,AAEL017567和AAEL004944在黑腹果蠅中的直系同源基因分別為CG17571-thetaTry,thetaTry-CG17571,Nep5和Muc12Ea(Matthewsetal.,2016)。47個hub基因中，29個基因為已知功能基因。如與雌成蚊觸角特異性相關的green模塊中，共篩選出9個hub基因(表3)，其中AAEL010426和AAEL001510被描述為氣味受體家族基因(Heetal.,2015;Matthewsetal.,2016)；AAEL014089屬于離子受體家族基因；AAEL010214編碼卷曲螺旋結構域蛋白，AAEL012424編碼微管蛋白。與雌成蚊喙特異性相關的purple模塊中，共篩選出6個hub基因(表3)，其中AAEL000011和AAEL000039屬于離子受體家族基因(Matthewsetal.,2016)；AAEL002600,AAEL013033和AAEL013032被描述為絲氨酸蛋白酶家族基因(Bartholomayetal.,2004;Matthewsetal.,2016)。與雌成蚊下顎須特異性相關的red模塊中，共篩選出9個hub基因(表3)，其中AAEL011624屬于絲氨酸蛋白酶家族基因，AAEL000044屬于鳥氨酸脫羧酶家族基因，AAEL013417編碼血管生成素相關蛋白(Matthewsetal.,2016)；AAEL007033編碼A-凝集素錨定亞基，AAEL003405為微管動態(tài)蛋白的調(diào)節(jié)因子，AAEL006920被描述為G蛋白偶聯(lián)受體家族基因(Bartholomayetal.,2004;Matthewsetal.,2016)。篩選到的hub基因功能與組織功能相關，表明篩選到的基因較為可靠，但有的hub基因的報道研究甚少，提示后續(xù)可進一步通過blast,RT-PCR以及RNA干擾等手段對篩選到的hub基因功能進行預測和檢驗。Matthews等(2016)認為2個與氨轉(zhuǎn)運有關的基因AAEL007373和AAEL008046可能參與埃及伊蚊尋找宿主過程中氨的檢測，本研究WGCNA分析結果發(fā)現(xiàn)AAEL007373被劃分到green模塊，其在雌/雄蚊觸角中高表達，AAEL008046被劃分到blue模塊，其在雌/雄蚊腦中高表達,這與Matthews等(2016)報道相符，此外，本研究構建了以這兩個基因為核心的局部網(wǎng)絡，揭示其基因網(wǎng)絡關系(圖5)。AAEL000252被報道為雌蚊富集表達基因(Matthewsetal.,2016)，在本研究中被劃分到turquoise模塊，其在雌成蚊卵巢中高表達；AAEL010631被報道為雄蚊富集表達基因(Matthewsetal.,2016)，被劃分到magenta模塊，其在雄成蚊腹部末端中高表達。

本研究是基于WGCNA方法和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對蚊蟲不同組織基因共表達模式的首次探索。構建了埃及伊蚊成蚊9種組織加權基因共表達網(wǎng)絡，獲得了11個基因共表達模塊，其中，6個模塊與組織特異性相關。完成了組織特異性模塊內(nèi)基因的功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些模塊的生物學功能均與對應組織功能密切相關。此外，鑒定了6個組織特異性模塊內(nèi)共47個hub基因，揭示了其基因互作網(wǎng)絡關系。本研究結果可為蚊蟲基因共表達模式分析提供方法基礎，對探究蚊蟲不同組織特有的基因資源信息以及功能基因生物信息研究有參考價值。