綠僵菌MaFZ-13對橙帶藍尺蛾幼蟲致病力及林間防治效果

鄭 宏

(龍巖市新羅區(qū)森林病蟲害防治檢疫站,福建龍巖 364000)

羅漢松Podocarpusmacrophyllus和竹柏Podocarpusnagi四季常青、樹形優(yōu)美，國內分布于秦嶺至長江下游以南至海南和臺灣(吳征鎰,2004)，尤其在福建、廣東、廣西、海南、臺灣等省區(qū)廣泛種植，是重要的園林綠化、庭院觀賞樹種，除了具有較高的美學觀賞價值外，還具有較高的醫(yī)學藥用價值(夏聰?shù)?2015;黃相玲等,2018)。

橙帶藍尺蛾Milioniabasalis又名黃帶枝尺蛾、羅漢松尺蛾、橙帶丹尺蛾，屬鱗翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)，目前發(fā)現(xiàn)其幼蟲只取食羅漢松和竹柏這兩種羅漢松科植物；其成蟲色彩艷麗，在白天活動，有人誤認為是蝴蝶(圖1)。據(jù)報道，該蟲曾在日本嚴重危害羅漢松(Kamata,2002)；國內最早在2012年廣西博白林場發(fā)現(xiàn)嚴重危害竹柏(王緝健等,2014)，其后在海南、廣東和臺灣等地陸續(xù)有羅漢松上成災的報道(余海濱等,2015;林偉等,2017)，肖斌等(2019)報道2017年在江西省大余縣也發(fā)現(xiàn)該蟲。嚴重發(fā)生時，每株蟲口密度高的達數(shù)百頭，食量驚人，可將植物的葉片取食殆盡。由于該蟲一年多代，世代重疊，部分植株因遭受連續(xù)危害而無法萌發(fā)新葉導致死亡。橙帶藍尺蛾近年在福建省也有零星發(fā)生，起初并未引起重視。2018年以來該蟲危害區(qū)域和危害程度迅速擴大，特別是在閩南(泉州、廈門、漳州)以及閩西龍巖新羅區(qū)發(fā)生嚴重，德化縣美湖鎮(zhèn)桂格村一株360余年、樹圍達6 m的“狀元樹”竹柏，葉片被取食后只剩光禿的枝干；2019年在福州、三明、南平等地也有數(shù)十株至數(shù)百株連片林木葉片被吃光的現(xiàn)象，同年8月在福州市晉安區(qū)壽山鄉(xiāng)林陽寺內一株千年羅漢松，數(shù)天內葉片被取食60%以上。

圖1 橙帶藍尺蛾成蟲及其幼蟲在竹柏上的危害狀Fig.1 Damage symptoms of Milionia basalis adults and larvae on Podocarpus nagiA:停息在羅漢松樹干上的成蟲Adult resting on the trunk of P.macrophyllus;B:幼蟲群集取食竹柏Larvae feeding in group on P.nagi.

目前，關于該蟲的防治技術研究很少，在發(fā)現(xiàn)蟲口密度較高時大多以噴灑觸殺性化學農藥進行防治，雖可快速抑制蟲口，但是其負面效應也明顯，尤其是羅漢松、竹柏基本上是園林綠化樹種，種植區(qū)域多是人員活動比較頻繁的地方，蟲害的發(fā)生和防治更易受到關切，顯然不宜過多使用化學農藥。因此，探尋該蟲高效、環(huán)保的生物防治資源十分迫切。綠僵菌Metarhiziumspp.是應用最為廣泛的蟲生真菌之一，因其具有致病力強、對人類和脊柱動物安全、對環(huán)境友好和易大量培養(yǎng)等優(yōu)點，在國內外農林害蟲的防治中發(fā)揮了重要作用(蒲蟄龍和李增智,1996;周燚等,2006;Zimmermann,2007;何學友等,2011;潘春燕等,2016;楊華等,2018;Bogdányietal.,2019)，甚至作為生物殺蟲劑在巴西等國應用于防治牛身上的蜱螨——微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus(Beys-da-Silvaetal.,2020)。福建省林業(yè)科學研究院的研究人員通過比較不同來源金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopliae菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的致病力，篩選出了一株優(yōu)良綠僵菌菌株MaFZ-13(何學友等,2020)。本研究在此基礎上，利用時間-劑量-死亡率模型(TDM)分析了綠僵菌MaFZ-13對橙帶藍尺蛾幼蟲的時間效應和劑量效應的互作，并進行了初步林間防治試驗，為今后開展綠僵菌防治提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和試蟲

1.1.1菌株：供試菌株為金龜子綠僵菌M.anisopliaeMaFZ-13(以下簡稱綠僵菌MaFZ-13)，該菌株由福建省林業(yè)科學研究院森林保護研究所研究人員分離、保存。

1.1.2試蟲來源及飼養(yǎng)：供試橙帶藍尺蛾為3齡幼蟲，采集于福建省尤溪縣羅漢松苗圃。幼蟲采集后置于大養(yǎng)蟲籠中，帶回實驗室以新鮮羅漢松枝葉飼養(yǎng)1 d后，挑選健康幼蟲分裝入昆蟲飼養(yǎng)盒中，每飼養(yǎng)盒放置15頭作為室內生物測定試驗的1個重復。

1.2 生物測定

1.2.1孢子懸浮液配制：試驗前，將供試綠僵菌菌株斜面上孢子轉接到PDA平板(直徑9 cm)培養(yǎng)基上，置于25±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，待平板培養(yǎng)基上長滿墨綠色孢子后，即可收集孢子用于試驗接種。參考何學友等(2011)方法，收集平板培養(yǎng)基表面的孢子后用0.03%吐溫-80水溶液配制孢子懸浮液，依次配制成1.0×109,1.0×108,1.0×107,1.0×106和1.0×105孢子/mL 5個濃度的孢子懸浮液。

1.2.2人工接種和致病力測定：將上述1.1.2節(jié)試蟲進行接種試驗。每個濃度孢子懸浮液處理6個重復，即每個濃度處理90頭幼蟲；對照組用0.03%吐溫-80水溶液處理，4個重復，共60頭幼蟲。使用微量噴霧器將孢子懸浮液均勻噴在試蟲的體表，每重復噴菌液2 mL，處理完后，將試蟲置于吸水紙上置放20 s，以避免蟲體上太多液體易導致死亡。處理后將幼蟲重新置于干凈的養(yǎng)蟲盒，以新鮮的羅漢松枝葉飼養(yǎng)，每2 d更換一次。每天記錄不同處理的幼蟲存活情況。死亡后的幼蟲保濕處理，以便觀察是否為綠僵菌感染。接種測定在2019年5月下旬至6月上旬進行，室內環(huán)境溫度為18～31℃。

1.3 林間防治試驗

1.3.1菌液配制：林間防治用綠僵菌孢子使用液固雙相發(fā)酵法生產(由福建省林業(yè)科學研究院森保所研究人員制作并提供)，制成的粗粉劑為5.0×109孢子/g，干燥后密封置于4℃冰箱保存。防治時用0.03%吐溫-80水溶液將菌粉配制成濃度為1.0×108孢子/mL孢子懸浮液，配制后用雙層紗布過濾，使用背負式電動噴霧器進行林間噴霧。菌液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2林間施菌：試驗地在龍巖市新羅區(qū)紅坊鎮(zhèn)船巷村竹柏苗圃，位于山腳東坡，竹柏高2～5 m，蟲口密度40～156頭/株。2019年7月13日16∶00時以后噴菌1次，菌液在苗圃的植株上全面噴施，以噴濕全部葉片(微微滴水)為準。噴施后，選取葉片受害率在30%～50%之間，間距在8～10 m的5株竹柏作為調查樣株，每樣株上選取樹冠中部合適的3根枝條進行套籠，套籠為長100 cm，直徑60 cm的尼龍紗籠，每籠中有15～20頭幼蟲，施菌后每天觀察橙帶藍尺蛾幼蟲的活力及取食情況，在3,6和9 d調查幼蟲死亡率。對照為距離施菌圃地30～40 m遠沒有施菌的竹柏，噴灑0.03%吐溫-80的清水，設置4個套籠60頭幼蟲。

1.4 數(shù)據(jù)分析

時間-劑量-死亡率(time-dose-mortality,TDM)模型分析試驗數(shù)據(jù)在DPS數(shù)據(jù)處理軟件(v7.05版本)進行分析處理，使用軟件自帶的模型對生測數(shù)據(jù)進行模擬，得到綠僵菌對橙帶藍尺蛾幼蟲致病力的TDM模型參數(shù)估計，進而分析時間效應和劑量效應(馮明光,1998;唐啟義和馮明光,2002)。

林間防治試驗防治效果計算方法見下式：

防治效果(%)=

2 結果

2.1 接種孢子懸浮液后幼蟲累計死亡率變化

橙帶藍尺蛾幼蟲接種綠僵菌MaFZ-13不同濃度孢子懸浮液后，累計死亡率情況見圖2。累計死亡率隨時間增大，孢懸液濃度越大，幼蟲的死亡速度越快。接種1.0×109孢子/mL孢子懸浮液6 d后，幼蟲死亡率超過80%；8 d時達到100%；接種1.0×108孢子/mL孢子懸浮液7 d時，幼蟲死亡率超過80%，10 d時死亡率達到100%。接種1.0×107孢子/mL孢子懸浮液時，幼蟲死亡速度略慢一些，死亡高峰出現(xiàn)在3-8 d，接種9 d后，死亡達到80%；接種15 d后，幼蟲死亡率為95.6%。接種1.0×106和1.0×105孢子/mL兩個濃度的孢子懸浮液時，幼蟲死亡速度相對較慢，接種后15 d，累計死亡率分別為82.7%和71.1%。處理組蟲尸經保濕培養(yǎng)后，大部分表現(xiàn)出綠僵菌感染的情況，體表先長出白色菌絲，隨后產生大量墨綠色孢子(圖3)。

圖2 橙帶藍尺蛾幼蟲接種不同濃度綠僵菌MaFZ-13菌株孢子懸浮液后的累計死亡率Fig.2 Cumulative mortality of Milionia basalis larvae inoculated with different concentrations of spore suspension of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13

圖3 橙帶藍尺蛾幼蟲被綠僵菌感染狀Fig.3 Symptoms of Milionia basalis larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.2 時間-劑量-死亡率模型分析

表1 綠僵菌MaFZ-13菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的時間-劑量-死亡率(TDM)模型模擬與參數(shù)估計Table 1 Parameters estimated from modeling of the time-dose-mortality (TDM) by bioassay of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 against Milionia basalis larvae

各處理濃度與時間效應參數(shù)的t測驗值均達到極顯著水平(P<0.01)，說明綠僵菌MaFZ-13菌株劑量效應與時間效應極顯著。該菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲的劑量效應參數(shù)β為0.4483，時間效應參數(shù)在橙帶藍尺蛾幼蟲接種后第7天 (γ7) 達到最大，表明該時間段幼蟲死亡數(shù)較多。

2.3 綠僵菌MaFZ-13對幼蟲的劑量和時間效應

綠僵菌MaFZ-13菌株對橙帶藍尺蛾幼蟲死亡率的TDM模型估計的劑量效應見圖4，隨著接種時間的延長，LC50和LC90值逐漸下降，綠僵菌接種橙帶藍尺蛾幼蟲后4,5,6和7 d的半致死劑量(LC50)對數(shù)值分別為7.99,7.12,6.46和5.83。接種后3 d以內幼蟲死亡率較小，所以LC50和LC90估計值偏大。

圖4 綠僵菌MaFZ-13菌株接種橙帶藍尺蛾幼蟲后各時段LC50和LC90的對數(shù)值Fig.4 Logarithms of the time-dependent LC50and LC90 values for Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 against Milionia basalis larvae

綠僵菌MaFZ-13對橙帶藍尺蛾致病力的時間效應見表2。致死時間(LT50和LT90)隨著孢懸液濃度的增加而遞減(表2)，1.0×107,1.0×108和1.0×109孢子/mL孢子懸浮液引起的LT50值分別為5.19,3.99和2.81 d，對應的LT90值分別為10.89,8.07和6.26 d。1.0×105和1.0×106孢子/mL兩個濃度孢子懸浮液接種后幼蟲死亡率未達到90%，無法估計出LT90的值。

表2 不同濃度綠僵菌MaFZ-13菌株孢子懸浮液對橙帶藍尺蛾幼蟲的LT50和LT90值Table 2 The LT50and LT90 values for different concentrations of spore suspension of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 against Milionia basalis larvae

2.4 綠僵菌MaFZ-13對橙帶藍尺蛾的林間防治效果

用1.0×108孢子/mL孢子懸浮液在林間噴霧防治結果見圖5。根據(jù)林間套籠觀察，幼蟲死亡率隨時間增高；噴菌后3 d，雖幼蟲死亡率不高，但大部分幼蟲活力下降，取食量減少，危害性降低；噴菌后6 d死亡率為65.4%，防治效果為64.03%；噴菌后9 d幼蟲死亡率可達到85.8%，防治效果為85.05%。

圖5 1.0×108孢子/mL綠僵菌MaFZ-13菌株孢子懸浮液對橙帶藍尺蛾幼蟲的林間防治效果Fig.5 Control efficacy of spore suspension of Metarhizium anisopliae strain MaFZ-13 at the concentration of 1.0×108 conidia/mL against Milionia basalis larvae in the field

3 討論

橙帶藍尺蛾是近年來危害羅漢松和竹柏的一種新害蟲，其危害呈現(xiàn)明顯的暴發(fā)性特點，在局部區(qū)域造成了嚴重的損失(王緝健等,2014;余海濱等,2015;林偉等,2017;肖斌等,2019)。目前關于該蟲的發(fā)生規(guī)律尚沒有系統(tǒng)的研究報道。由于幼蟲在取食過程中可將寄主植物含有的羅漢松內酯A糖苷(inumakilactone A glucoside)、竹柏內酯(nagilactone)等有毒成份轉移入體內，使鳥類避食(Yasui,2001)，據(jù)林農反映，捉其幼蟲飼喂家禽，罕見取食；其成蟲、幼蟲顏色和斑紋醒目，具有明顯的警戒色；該蟲的天敵少見，我們在調查與飼養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)幼蟲被球孢白僵菌Beauveriabassiana、蛹期有棒束孢(擬青霉)寄生外，其他天敵較少。這些也可能是造成暴發(fā)成災的原因之一。因此，篩選對致病力強的優(yōu)良綠僵菌菌株，為防治該蟲提供高效的生物防治資源十分必要。

研究結果顯示接種綠僵菌MaFZ-13后，橙帶藍尺蛾幼蟲的累計死亡率隨時間增大，孢懸液濃度越大，幼蟲的死亡速度越快(圖2)。時間-劑量-死亡率(TDM)模型分析結果表明綠僵菌對其致死過程中的劑量效應和時間效應存在顯著的互作關系(表1)，當孢子濃度為1.0×108孢子/mL時，致死中時(LT50)值為3.99 d(表2)，可見綠僵菌MaFZ-13是一株對其幼蟲具有較強致病力的菌株，具有較好的應用潛力。林間防治試驗結果(圖5)顯示，1.0×108孢子/mL孢子懸浮液噴菌9 d后防治效果可達85%，研究結果為利用該菌株進行防治提供了依據(jù)。從節(jié)約成本考慮，林間防治推薦使用1.0×107～1.0×108孢子/mL是較理想的施菌濃度。同時，要加強該蟲發(fā)生的預測預報工作，目前生產上防治明顯滯后，如果能在其低齡幼蟲期防治，易取得較好的效果，達到事半功倍的目的。另外，由于該蟲在地面枯枝落葉或淺層土壤中化蛹，可以考慮在地面噴撒粉劑，操作更為簡便。羅漢松、竹柏等大多是園林綠化樹種，野外環(huán)境復雜多樣，合適的施用劑型和最佳的施菌時間需要進一步研究。

任何殺蟲劑生物活性的劑量效應和時間效應之間是互作的，TDM模型可以將時間和劑量(濃度)效應統(tǒng)一到一個模型(Nowierskietal.,1996;王聯(lián)德等,2003;Qiuetal.,2013;王定峰等,2013)，避免了機率分析中時間效應和劑量(濃度)效應相互排斥的問題，能充分利用生物測定的數(shù)據(jù)信息，在評價真菌殺蟲劑的致病性方面具有較好的應用價值，應用該模型來分析評價菌株的生防潛力更加全面可靠。

致謝研究工作中，福建省林業(yè)科學研究院何學友教授級高級工程師、蔡守平高級工程師、宋海天博士等給予大力支持，在此表示衷心感謝！