結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)的影響

陳 堅(jiān) 陳 彬 鄭斯平 鄭益平 朱炳耀 鄭偉文

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 福州 350003)

水生蕨類(lèi)植物滿(mǎn)江紅(Azolla)廣泛分布于溫帶和熱帶淡水生態(tài)系統(tǒng)。滿(mǎn)江紅俗稱(chēng)紅萍、綠萍, 因富含氮素和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分, 在亞洲農(nóng)村被用作綠肥和飼料已有數(shù)百年歷史[1,2]。這種細(xì)小的植物繁殖快, 生物量高, 歸因于其葉腔中棲息著一種固氮藍(lán)藻。固氮藍(lán)藻是屬于革蘭氏陰性細(xì)菌的光自養(yǎng)原核生物, 故又稱(chēng)藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacterium)。與滿(mǎn)江紅共生的藍(lán)藻形態(tài)酷似念珠藻(Nostoc), 一般稱(chēng)為滿(mǎn)江紅念珠藻(Nostoc azollae), 是由多個(gè)細(xì)胞串聯(lián)成的絲狀體, 含有營(yíng)光合作用的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和專(zhuān)司固氮的異形胞。異形胞含有編碼固氮酶的nif基因, 可將大氣氮轉(zhuǎn)化為植物可利用的結(jié)合態(tài)氮, 以NH4的形態(tài)滿(mǎn)足宿主生長(zhǎng)對(duì)氮素的需求。宿主則以蔗糖為主的碳源作為回報(bào)[3,4]。研究表明, 添加結(jié)合態(tài)氮無(wú)助于滿(mǎn)江紅的生長(zhǎng), 甚至危及共生藍(lán)細(xì)菌的生存[1]。這是因?yàn)榻Y(jié)合態(tài)氮的存在不僅不利于藍(lán)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分化為固氮的異形胞, 而且會(huì)抑制異形胞的固氮功能[5—8]。

自20世紀(jì)70、80年代曾經(jīng)的“紅萍熱”以來(lái), 本實(shí)驗(yàn)室和國(guó)內(nèi)外的研究機(jī)構(gòu)對(duì)滿(mǎn)江紅-藍(lán)細(xì)菌共生固氮的基礎(chǔ)生物學(xué)進(jìn)行了多年持續(xù)的研究, 發(fā)現(xiàn)并證實(shí)滿(mǎn)江紅在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了特殊構(gòu)造,專(zhuān)供藍(lán)藻棲息的葉腔和腺毛[9]。腺毛有兩種: 發(fā)生于滿(mǎn)江紅葉原基的初生分支腺毛(Primary branched hair, PBH; 由一個(gè)基細(xì)胞和多個(gè)端細(xì)胞組成)和形成于葉腔的次生單支腺毛(Secondary single hair, SSH;僅由一個(gè)基細(xì)胞和一個(gè)端細(xì)胞構(gòu)成)[10]。它們不僅是宿主與共生藻進(jìn)行氮、碳等物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞的特殊結(jié)構(gòu), 又是共生藻在滿(mǎn)江紅的無(wú)性繁殖階段從莖尖向葉腔, 從母體向幼體進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移的紐帶; 也是共生藻在滿(mǎn)江紅的有性繁殖階段從莖尖向孢子果, 從親代向子代進(jìn)行垂直轉(zhuǎn)移的橋梁[4,11—13]。滿(mǎn)江紅的這些特殊構(gòu)造給共生藻以穩(wěn)定和封閉的生存空間, 讓蕨與藻終生相伴, 使兩者共生關(guān)系世代永續(xù)。這正是滿(mǎn)江紅有別于地球上現(xiàn)有的植物-微生物共生固氮體系的獨(dú)特之處[14]。隨著滿(mǎn)江紅及其共生藍(lán)藻全基因組測(cè)序的完成, 以滿(mǎn)江紅作為模式植物, 進(jìn)行植物-微生物相互作用和微生態(tài)研究已日益受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注[8,15,16]。

近30年來(lái), 人們先后從滿(mǎn)江紅的葉腔發(fā)現(xiàn)并分離培養(yǎng)出其第三個(gè)共生伙伴——細(xì)菌。它們與固氮藍(lán)藻一起構(gòu)成了滿(mǎn)江紅葉腔內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)。而早在20世紀(jì)90年代, 6個(gè)國(guó)家9個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究者均以自然界的滿(mǎn)江紅作為研究滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的材料, 采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法, 從4個(gè)生物種的滿(mǎn)江紅中分離鑒定出9個(gè)屬15個(gè)種的內(nèi)生細(xì)菌[17,25]。本實(shí)驗(yàn)室鄭偉文等[12]用電子顯微鏡證明自然界的滿(mǎn)江紅和人工培養(yǎng)的無(wú)藻滿(mǎn)江紅均有伴生細(xì)菌。Nierzwicki等[20,21]應(yīng)用電鏡技術(shù)將滿(mǎn)江紅葉腔內(nèi)生細(xì)菌分為6個(gè)超微結(jié)構(gòu)類(lèi)型。這些研究均從形態(tài)結(jié)構(gòu)方面反映了內(nèi)生細(xì)菌的多態(tài)性。進(jìn)入21世紀(jì)后,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步, 美國(guó)Raensallae大學(xué)的Lechno等[26]用rDNA-PCR 等方法從卡洲滿(mǎn)江紅的葉腔中分離鑒定出根癌農(nóng)桿菌、根瘤菌等4種細(xì)菌。本實(shí)驗(yàn)室鄭斯平等[27]用PCR-DGGE和電鏡技術(shù)對(duì)滿(mǎn)江紅的葉腔和孢子果內(nèi)細(xì)菌的進(jìn)行了檢測(cè)和觀察, 揭示了小葉滿(mǎn)江紅葉腔以變形菌門(mén)為主的多種可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細(xì)菌, 把對(duì)滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌的表型多樣性的研究推進(jìn)了一步。隨后, 鄭斯平等[28]將小葉滿(mǎn)江紅的內(nèi)生菌經(jīng)16S rDNA-PCR擴(kuò)增后用T-RFLP技術(shù)和PAT軟件分析, 通過(guò)比對(duì)確定這些內(nèi)生菌屬于10科42屬。

本文報(bào)道用高通量測(cè)序和電子顯微鏡技術(shù)研究結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿(mǎn)江紅體內(nèi)以共生藍(lán)細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌群落的遺傳組成和物理結(jié)構(gòu)的影響, 及其對(duì)滿(mǎn)江紅形態(tài)建成的間接效應(yīng), 試圖為通過(guò)內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)進(jìn)而改變宿主的生長(zhǎng)發(fā)育提供新的線(xiàn)索與思路。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源與制備

本研究的實(shí)驗(yàn)材料為小葉滿(mǎn)江紅(Azolla microphyllaKaulfus), 早先從國(guó)際水稻研究所(International Rice Research Institute)引進(jìn), 原編號(hào)為IRRI 4018。

表面滅菌的滿(mǎn)江紅制備為了排除外源細(xì)菌等微生物的干擾, 參照白克智等[29]的莖尖培養(yǎng)法,略有修改, 具體如下: 取100 g(鮮重)在自然條件下生長(zhǎng)的萍體, 用自來(lái)水清洗, 去掉黏附的土壤等雜物, 細(xì)心剪去根系。后選取健康的萍體再用無(wú)菌水清洗。撈取洗凈的健康萍體, 置于滅菌的燒杯中,加入適量的0.1%升汞溶液, 將萍體浸沒(méi), 用滅菌的鑷子連續(xù)攪拌3min30s, 使?jié)M江紅的葉、莖和幼根充分與溶液接觸, 以確保滅菌效果。隨后傾盡升汞溶液, 迅速用無(wú)菌水清洗經(jīng)滅菌的萍體, 至少清洗4次, 每次3min, 盡量洗去殘留在萍體上的升汞。在立體解剖鏡下用無(wú)菌的細(xì)針挑取并棄去包被莖尖的葉片, 僅保留莖尖分生組織和1—2個(gè)葉原基, 后投入滅菌的IRRI無(wú)氮培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)。IRRI培養(yǎng)液的配方為(mg/L): NaH2PO4·H2O 89; K2SO489.1;CaCl2·2H2O 147; MgSO4·7H2O 405.3; MnCl2·4H2O 1.8; Na2Mo2·2H2O 0.38; H3BO31.14; ZnSO4·7H2O 0.04; CuSO4·5H2O 0.04; CoCl2·6H2O 0,04; EDTAFe (FeSO4·7H2O 0.249, EDTA 0.261, KOH 0.157)。培養(yǎng)液ppH6.5。

無(wú)藻滿(mǎn)江紅的制備取以上述經(jīng)表面滅菌并洗凈的萍體, 將按上法剝離的莖尖分生組織逐個(gè)分別接入裝有Nickell培養(yǎng)液的三角瓶中培養(yǎng)。Nickell培養(yǎng)液的配方是(mg/L): KNO3202; KCl 150;KH2PO4 136; Cu(NO3)2·4H2O 708; CaCl2167;MgSO4·7H2O 246; MgCl296; H3BO30.1; MnSO4·4H2O 0.1; ZnSO4·4H2O 0.3; CuSO4·5H2O 0.1; Na2MoO4·2H2O 0.1; EDTA-Na2370; FeSO4·7H2O 280。培養(yǎng)液pH 6.5。

以上操作均在本研究所組培實(shí)驗(yàn)室的無(wú)菌環(huán)境下(蘇凈SW-CJ-2F型)完成。培養(yǎng)條件為: 26℃/18℃(日/夜), 光強(qiáng)550 μmol/(m2·s)。10—15d更新培養(yǎng)液。待繁殖足量后分別稱(chēng)取樣品用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2 掃描電鏡樣品制備與觀察

選取上述滿(mǎn)江紅植株的營(yíng)養(yǎng)體, 在解剖鏡下細(xì)心去除根系后, 將剝離的萍體用2.5%戊二醛溶液(0.1 mol/L磷酸緩沖液, pH7.4)在室溫下固定4h, 用同樣的磷酸緩沖液洗滌3次后, 用2%鋨酸在4℃下固定2h, 又經(jīng)磷酸緩沖液充分洗滌后, 用乙醇逐級(jí)脫水, 并經(jīng)環(huán)氧丙烷替換兩次。試樣用HCP-2型臨界點(diǎn)干燥器干燥, 將經(jīng)干燥的樣品黏附于銅臺(tái)上,在高倍解剖鏡下用細(xì)針解剖, 使?jié)M江紅葉腔內(nèi)的微生物群落充分暴露, 再用IB-5型離子濺射儀噴鍍鉑鈀, 用JEOL JSM-6380lv 型掃描電子顯微鏡觀察并拍片, 加速電壓15 KV。

1.3 滿(mǎn)江紅DNA提取與16S rRNA基因和nif基因的PCR擴(kuò)增

采用DNA提取試劑盒(上海生工) 和說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取樣本的DNA, 用0.7%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)檢測(cè)所提取DNA的完整性。

以提取的滿(mǎn)江紅基因組DNA為模板, 在ABI GeneAmp?9700型反應(yīng)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。細(xì)菌16S rDNA引物為: 338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′), 806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′), 反應(yīng)體系20 μL, 包含: 4 μL的5×FastPfu Buffer; 2 μL的2.5 mmol/L dNTPs; 各0.8 μL的正向擴(kuò)增引物 (5 μmol/L) 及反向擴(kuò)增引物(5 μmol/L); 0.4 mL TransStartFastPfu聚合酶; 0.2 μL BSA; 10 ng模板 DNA; 補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃預(yù)變性3min, 27循環(huán)(95℃變性30s, 55℃退火45s, 72℃延伸1.5min); 72℃延伸 10min。

nif基因的擴(kuò)增引物為nifH-F(5′-AAAGGYGG WATCGGYAARTCCACCAC-3′),nifH-R(5′-TT GTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′)。PCR反應(yīng)參數(shù)為: 95℃預(yù)變性3min, 35循環(huán)(95℃變性20s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min), 72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后, 委托上海美吉生物科技有限公司用Illumina的MiSeq測(cè)序儀對(duì)rRNA基因的擴(kuò)增序列進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與生物信息學(xué)分析

用Flash軟件對(duì)Miseq測(cè)序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接, Trimmomatic軟件對(duì)拼接序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾, 獲得高質(zhì)量的Tags序列。在Usearch(vsesion 7.0)平臺(tái), 按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類(lèi)單元(Operation taxonomic unit, OTU)聚類(lèi), 在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體, 得到OTU的代表序列。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息, 基于silva數(shù)據(jù)庫(kù), 采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析, 并分別在從域(Domain)到種(Species)各個(gè)分類(lèi)學(xué)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。分析在美吉生物科技有限公司的生物云平臺(tái)(i-sanger)上完成。

2 結(jié)果

2.1 表面無(wú)菌的含藻滿(mǎn)江紅與無(wú)藻滿(mǎn)江紅的獲得與驗(yàn)證

得到植株表面無(wú)外源微生物污染, 但葉腔仍含有共生藍(lán)藻(下稱(chēng)symbiont或cyanobiont)為優(yōu)勢(shì)種的內(nèi)生細(xì)菌群落的滿(mǎn)江紅樣本是進(jìn)行本研究的前提。參照白克智[29]的方法, 經(jīng)過(guò)近2個(gè)月的莖尖組織培養(yǎng), 取得了在IRRI無(wú)氮培養(yǎng)液正常生長(zhǎng)的小葉滿(mǎn)江紅群體, 成功率為10%。驗(yàn)證方法有三: (1)培養(yǎng)60d后, 培養(yǎng)液潔凈通透, 未見(jiàn)污染; (2)用掃描電鏡隨機(jī)檢查10株萍體及其根系, 萍體葉片, 尤其是根毛間隙未見(jiàn)到任何細(xì)菌(圖 1), 而葉腔中以共生藍(lán)細(xì)菌為主的內(nèi)生細(xì)菌群落與自然界的滿(mǎn)江紅葉腔菌落無(wú)異(圖 3)而在自然條件下生長(zhǎng)的滿(mǎn)江紅,可見(jiàn)細(xì)菌附著于植株, 尤其是根表皮細(xì)胞(圖 1)。通過(guò)莖尖組織培養(yǎng)也取得了在Nickell富氮培養(yǎng)液健康生長(zhǎng)的萍體。成功率為5%。驗(yàn)證方法同上。即培養(yǎng)60d后, 結(jié)合態(tài)氮豐富的Nickell培養(yǎng)液依然澄清潔凈, 葉片和根表未見(jiàn)微生物存在, 且葉腔內(nèi)未見(jiàn)Nostoc azollae存在的跡象(參見(jiàn)2.2); (3)用nifHPCR和測(cè)序檢測(cè)(詳見(jiàn)2.3和2.4)。電鏡觀察和nifHPCR檢測(cè)結(jié)果均表明本研究采用的方法是成功的。本文將表面無(wú)菌、葉腔中含有以Nostoc azollae為優(yōu)勢(shì)的微生物群落、nifH-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的滿(mǎn)江紅, 簡(jiǎn)稱(chēng)為含藻滿(mǎn)江紅(Azollawith symbiont), 葉腔中未見(jiàn)共生藻且測(cè)序檢測(cè)無(wú)Nostoc azollae者即稱(chēng)為無(wú)藻滿(mǎn)江紅(symbiont-freeAzolla)。

圖 1 滿(mǎn)江紅根部表面的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 1 Images of the root surface of Azolla by SEM

氮素對(duì)滿(mǎn)江紅表觀形態(tài)的建成有明顯的影響。如圖 2所示, 在無(wú)氮條件下生長(zhǎng)滿(mǎn)江紅樣品(AmA)的萍體大小和葉片間距分別比無(wú)藻滿(mǎn)江紅(AmB)大約20%和15%。而后者背葉裂片上的乳頭狀突起(papillae)明顯凸起, 前者卻略顯扁平。用掃描電鏡對(duì)葉腔的觀察表明: 添加結(jié)合態(tài)氮并不影響滿(mǎn)江紅葉腔和腺毛的發(fā)生, 但對(duì)其中存在的共生藍(lán)藻Nostoc azollae卻發(fā)生了可鑒別的變化, 即在自然及無(wú)氮生長(zhǎng)條件下明顯可見(jiàn)的共生藍(lán)藻全部消失。

2.2 含藻滿(mǎn)江紅與無(wú)藻滿(mǎn)江紅葉腔微生物群落的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

利用掃描電鏡對(duì)含藻滿(mǎn)江紅與無(wú)藻滿(mǎn)江紅葉腔中微生物群落的形態(tài)做進(jìn)一步觀察(圖 3—6), 可以看到兩者有如下差別: (1)含藻滿(mǎn)江紅葉腔中以Nostoc azollae為優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生菌占據(jù)了大部分的可用空間。由異形胞(小五星標(biāo)志)和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞組成的藍(lán)藻絲狀體纏繞于葉腔約15個(gè)單支腺毛細(xì)胞之間,并彼此連接成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu); 在其幼葉(葉齡為第2到第5葉),葉腔內(nèi)的細(xì)菌大多附著于藍(lán)藻細(xì)胞上, 或彼此聚集形成類(lèi)似生物被膜(biofilm)的構(gòu)造, 厚度約1 μm。眾多的藍(lán)藻和細(xì)菌細(xì)胞包埋在由多種分泌物構(gòu)成的基質(zhì)中(大星形標(biāo)志, 圖 4)。在成熟的葉腔(葉齡一般在在第6—7葉以上, 此時(shí)葉腔開(kāi)口完全封閉) 藍(lán)藻和細(xì)菌等微生物與葉腔內(nèi)的腺毛緊密結(jié)合, 形成一個(gè)大小與葉腔相適配的橢球形藻囊(Algal pocket), 外由一層約50 nm的薄膜包裹(圖 6)。打開(kāi)藻囊, 可見(jiàn)腺毛和藻、菌等相互交織, 形成多層次、多種結(jié)構(gòu)的生物被膜, 厚度可達(dá)2—5 μm(另文報(bào)道); (2)無(wú)藻滿(mǎn)江紅的從幼葉到老葉, 除了環(huán)繞在葉腔周?chē)南倜? 均未見(jiàn)Nostoc azollae。在低倍放大的電鏡視野中, 葉腔基本是中空的(圖 3)。在高倍放大的電鏡視野中, 可以看到形態(tài)各異的細(xì)菌附著于無(wú)藻滿(mǎn)江紅葉腔的腺毛細(xì)胞表面或分散在葉腔內(nèi)壁上, 但未見(jiàn)生物被膜存在, 更沒(méi)有形成藻囊結(jié)構(gòu)(圖 5)。

圖 2 含藻滿(mǎn)江紅(a)與無(wú)藻滿(mǎn)江紅(b)的表觀形態(tài)(掃描電鏡照片, 標(biāo)尺=1 mm)Fig. 2 The morphological appearance of Azolla with the symbiont(a) and symbiont-free Azolla (b) by SEM (Scale bar=1 mm)

2.3 內(nèi)生微生物的16S rRNA和nifH基因的PCR擴(kuò)增

應(yīng)用基因組試劑盒對(duì)含藻和無(wú)藻滿(mǎn)江紅提取總DNA, 分別以細(xì)菌的16S rRNA基因和nifH基因的區(qū)段設(shè)計(jì)引物, 以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果由圖 7可見(jiàn): 泳道1—4均在500 bp附近擴(kuò)增出單一的DNA條帶, 表明在滿(mǎn)江紅的培養(yǎng)基中無(wú)論是否添加氮素, 其內(nèi)生的細(xì)菌群落均具有16S rRNA基因和nifH基因區(qū)域的特異性擴(kuò)增。

2.4 滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因和nifH基因擴(kuò)增產(chǎn)物樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)

對(duì)分別在無(wú)氮和富氮兩種培養(yǎng)模式下的滿(mǎn)江紅樣本不同細(xì)菌群落的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量的測(cè)序分析, 將得到的代表16S rRNA基因和nifH基因區(qū)段的樣本測(cè)序數(shù)據(jù)總結(jié)在表 1中。

圖 3 掃描電鏡照片顯示結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿(mǎn)江紅莖尖區(qū)域共生藻的抑制效應(yīng)Fig. 3 The inhibitory effect of conbined nitrogen on the symbionts at the apical region of Azolla frond analyzed by SEM

圖 4 含藻滿(mǎn)江紅葉腔剖面的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 4 The profile of the fourth leaf cavity within the Azolla with symbiotic caynobacteria by SEM

由表 1可見(jiàn): 通過(guò)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的可變區(qū)和固氮菌nifH基因區(qū)段的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序, 對(duì)讀取的序列PE reads進(jìn)行拼接, 質(zhì)控和過(guò)濾后, 獲得標(biāo)簽Tags序列。從生長(zhǎng)于無(wú)氮培養(yǎng)基的滿(mǎn)江紅樣品(AmA)以及生長(zhǎng)于富氮培養(yǎng)基的滿(mǎn)江紅樣品(AmB)所得到的標(biāo)簽序列的數(shù)量, 堿基數(shù), 序列的平均長(zhǎng)度及長(zhǎng)度范圍比較而言, 兩者間差異并不大, 即使有所差異也無(wú)實(shí)際意義。但在Usearch(vsesion 7.0)平臺(tái), 按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類(lèi)單元(Operation taxonomic unit, OTU)聚類(lèi)后, 可以看出, 在富含結(jié)合態(tài)氮的Nickell培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的滿(mǎn)江紅(AmB), 其基于≥97%的相似度水平, 通過(guò)聚類(lèi)分析共獲得的有效OTUs的數(shù)目大幅度的減少, 其中以16S rRNA基因?yàn)闃?biāo)記的OTU減少了53%; 以nifH基因標(biāo)記的OTU減少了64%。由于IRRI培養(yǎng)基和Nickell培養(yǎng)基除氮素外, 其余培養(yǎng)成分基本相同。測(cè)序結(jié)果表明: 結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌無(wú)論是總菌群和固氮菌群的多樣性的減少起到了關(guān)鍵的作用。

2.5 含藻滿(mǎn)江紅與無(wú)藻滿(mǎn)江紅的細(xì)菌群落組成

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的細(xì)菌物種的分類(lèi)信息, 基于silva數(shù)據(jù)庫(kù), 采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,分別在各個(gè)分類(lèi)學(xué)水平: Domain(域)、Kingdom(界)、Phylum(門(mén))、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)、Species(種)統(tǒng)計(jì)出各樣本的群落組成,在各個(gè)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的分析。

圖 5 無(wú)藻滿(mǎn)江紅第四葉葉腔橫剖面的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 5 The cross profile of the fourth leaf cavity of the cyanobiontfree Azolla by SEM

圖 6 含藻滿(mǎn)江紅第七葉葉腔剖面掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 6 The profile of the seventh leaf cavity within Azolla with the symbiont by SEM

圖 7 滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig. 7 PCR products amplified from endophytic bacteria of Azolla

對(duì)16S rRNA基因標(biāo)記的全細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)分析表明(圖 8): 生長(zhǎng)在無(wú)氮和富氮兩種培養(yǎng)條件下的滿(mǎn)江紅葉腔中細(xì)菌群落的組成差異很大。在無(wú)氮條件下生長(zhǎng)的滿(mǎn)江紅(AmA)中檢出17個(gè)OTU, 分屬于4門(mén): 藍(lán)藻門(mén)Cyanobacteria(52.5%)、變形菌門(mén)Proteobacteria(47.4%)、硬壁菌門(mén)Firmicutes(0.059%)和擬桿菌門(mén)Bacteroidetes(0.0016%)。有2個(gè)OTU分別屬于藍(lán)細(xì)菌菌門(mén)Cyanobacteria的藍(lán)細(xì)菌目(10.44%)和未命名的Subsection IV目; 有11個(gè)分別屬于變形菌門(mén)中的草螺菌屬Herbspirillum(28.54%)、Niveispirillum菌屬(6.78%)和根瘤菌屬Rhizobium(4.42%);以及乳酸桿菌屬Lacibacterium、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas、大腸桿菌志賀菌屬Escherichia-Shigella、嗜甲烷菌屬M(fèi)ethylophilus、紅螺菌屬Rhodospirillales和假單胞菌屬Pseudomonas; 有3個(gè)屬于厚壁菌門(mén)Firmicutes的小桿菌屬Dialister(嗜血桿菌族)、鏈球菌屬Streptococcus和糞便桿菌Faecalibacterium。還有1個(gè)屬于擬桿菌Bacteroidetes中Bacteroides屬。而添加氮營(yíng)養(yǎng)明顯降低了滿(mǎn)江紅內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。其內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)明顯減少, 為8個(gè)OUTs, 分屬于4門(mén)。即藍(lán)藻門(mén)Cyanobacteria(86.79%), 均屬于藍(lán)藻目Cyanobacteria, 其余為變形菌門(mén)(13.12%)、放線(xiàn)菌門(mén)(0.061%)和厚壁菌門(mén)(0.038%)。與AmA相比, 屬于未命名Section Ⅳ目的藍(lán)細(xì)菌消失了。此外, 添加結(jié)合態(tài)氮也降低了變形菌門(mén)細(xì)菌的多樣性,其中具有固氮能力的草螺菌(Herbaspirillum)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等屬的細(xì)菌基本消失, 而假單胞菌(Pseudomonas)屬的成員成了優(yōu)勢(shì)菌(12.9%)。前三者菌在AmA中分別占有28.6%、6.7%和4.4%; 后者僅占3.67%。

表 1 不同滿(mǎn)江紅樣本的兩種細(xì)菌基因擴(kuò)增區(qū)段的測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab. 1 The summarized sequencing data of amplified fragments of two bacteria genes from different Azolla samples

圖 8 兩種滿(mǎn)江紅樣品16S rRNA基因的內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的群落豐度的百分比Fig. 8 Percent of community abundance of the endophytic bacteria in two Azolla samples based on 16S rRNA gene at genus level

2.6 nifH基因鑒別的內(nèi)生菌群落組成

16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果表明, 在富氮培養(yǎng)基生長(zhǎng)的無(wú)藻滿(mǎn)江紅樣品(AmB)中仍檢出了藍(lán)細(xì)菌, 且占優(yōu)勢(shì)。這些藍(lán)細(xì)菌是否固氮的Nostoc azollae? 本研究對(duì)固氮酶基因nifH的檢測(cè)給出了答案。

測(cè)序結(jié)果表明, 從含藻滿(mǎn)江紅樣品(AmA)中得到36959條序列, 而無(wú)藻滿(mǎn)江紅(AmB)也得到38869條序列。但兩者間的微生物的可操作分類(lèi)單元(OTU)明顯不同, 前者nifH測(cè)序序列形成14個(gè)細(xì)菌的OTU, 滿(mǎn)江紅共生體的nifH基因主要來(lái)自藍(lán)藻門(mén), 變形菌門(mén)和未知細(xì)菌的門(mén)類(lèi)。其中藍(lán)藻門(mén)的nifH基因的細(xì)菌群落占了88.44%的優(yōu)勢(shì), 劃分到種屬水平均為滿(mǎn)江紅的共生藍(lán)藻Nostoc azollae, 變形菌門(mén)中含有nifH基因的細(xì)菌群落占了11.32%, 包括固氮的草螺菌(Herbaspirillum)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)。在門(mén)水平無(wú)法認(rèn)定的固氮菌為0.23%。后者僅有5個(gè)OTUs, 來(lái)自變形菌門(mén)(99.71%)和未知門(mén)類(lèi)的細(xì)菌(0.29%),Pseudomonasstutzeri占99.54%, 還有0.16%含有nifH基因的細(xì)菌落無(wú)法認(rèn)定到綱的水平。值得注意的是藍(lán)藻門(mén)的nifH基因未檢出。這就是說(shuō)從無(wú)藻滿(mǎn)江紅(AmB)16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物檢出的藍(lán)藻并不是固氮的Nostoc azollae(圖 9)。

3 討論

3.1 結(jié)合態(tài)氮對(duì)Nostoc azollae的抑制效應(yīng)

自從白克智等[29]開(kāi)發(fā)出莖尖培養(yǎng)技術(shù)以來(lái), 經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室略加改進(jìn)后一直用此法獲得無(wú)藻滿(mǎn)江紅。比較IRRI和Nickelle培養(yǎng)液的化學(xué)組成, 兩者的主要差別在后者含有較多的結(jié)合態(tài)氮[KNO3,Ca(NO3)2], 表現(xiàn)出對(duì)共生藍(lán)藻的顯著抑制作用。為此我們通過(guò)剝離包裹共生藍(lán)藻的幼葉, 讓Nostocazollae與和Cu2+充分接觸。據(jù)我們觀察, 附著于莖尖的藍(lán)藻藻殖段(Homogonia)并不含異形胞(圖 3), 且生命力強(qiáng)。如不將之充分暴露于它們可能存活下來(lái)。Li Fay-Wei等[8]報(bào)道, 在培養(yǎng)液中添加NH4NO3可使?jié)M江紅體內(nèi)的共生藍(lán)藻消失,以致無(wú)法用PCR檢出nifH。我們也曾做了同樣的嘗試, 但經(jīng)過(guò)連續(xù)的繼代培養(yǎng)后其共生藍(lán)藻又“復(fù)活”了。而在Nickelle培養(yǎng)液生長(zhǎng)的無(wú)藻滿(mǎn)江紅投入無(wú)氮的IRRI培養(yǎng)液則難以存活。這說(shuō)明在結(jié)合態(tài)氮的“壓力”下, 滿(mǎn)江紅葉腔中絕大部分的藍(lán)藻消失了,但仍有極少數(shù)的藍(lán)藻細(xì)胞存活下來(lái)。

圖 9 兩種滿(mǎn)江紅樣品含nifH基因細(xì)菌在屬水平的群落豐度的百分比Fig. 9 Percent of community abundance of the endophytic bacteria in two Azolla samples based on nifH gene at genus level

值得指出的是, 在無(wú)藻滿(mǎn)江紅體內(nèi)盡管未檢出固氮的Nostoc azollae, 但仍有相當(dāng)數(shù)量其他不固氮的藍(lán)藻存在。這一結(jié)果顛覆了長(zhǎng)期以來(lái)的人們關(guān)于滿(mǎn)江紅的內(nèi)生藻就是Nostoc azollae的認(rèn)知。我們?cè)脽晒怙@微鏡和電鏡觀察到葉腔中無(wú)異形胞的藍(lán)藻(另文報(bào)道)。所以嚴(yán)格說(shuō)來(lái), 所謂含“藻”滿(mǎn)江紅和無(wú)“藻”滿(mǎn)江紅嚴(yán)格地說(shuō)應(yīng)是含Nostoc azollae和不含Nostoc azollae的滿(mǎn)江紅。而以往文獻(xiàn)中常用的Azolla-Anabaenasymbiosis 或Azolla-Nostocsymbiosis的提法也值得推敲。

3.2 結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿(mǎn)江紅葉腔中微生物群落組成的影響

本研究用I11umina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌的rRNA基因的可變區(qū)進(jìn)行了序列測(cè)定。這在很大程度上提高了對(duì)細(xì)菌群落組成進(jìn)行定性與定量的精確度。通過(guò)序列的算法分析, 在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體, 可以比較準(zhǔn)確地得到OTU的代表序列,從而比較精確地確定其對(duì)應(yīng)的物種信息, 還可以依據(jù)測(cè)序序列read的數(shù)量, 統(tǒng)計(jì)它們的相對(duì)豐度。

本研究結(jié)果再次證明, 在無(wú)氮條件下生長(zhǎng)的小葉滿(mǎn)江紅(A. microphylla)含有數(shù)量和種類(lèi)眾多的以藍(lán)細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)的內(nèi)生細(xì)菌。用高通量測(cè)序技術(shù)檢出了橫跨四個(gè)門(mén)類(lèi)的細(xì)菌, 僅變形菌門(mén)就有11個(gè)屬,還有大量不可培養(yǎng)的細(xì)菌種類(lèi), 目前為止從滿(mǎn)江紅中檢出細(xì)菌的門(mén)類(lèi)最多。本實(shí)驗(yàn)室鄭斯平等[28]用T-RFLP技術(shù)和PAT軟件, 分析結(jié)果表明從小葉滿(mǎn)江紅中有41個(gè)屬的細(xì)菌, 但大部分屬于變形菌門(mén)。Laerua等[30]用宏基因組測(cè)序技術(shù)和相關(guān)軟件分析,從蕨狀滿(mǎn)江紅(A. filiculoides)也檢出以Nostoc azollae為優(yōu)勢(shì)(60%—75%), 包括變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的內(nèi)生細(xì)菌。這兩種滿(mǎn)江紅內(nèi)生菌的主要類(lèi)群相似。

值得注意的是, 我們?cè)诤鍧M(mǎn)江紅葉腔中除了固氮的Nostoc azollae外, 也檢出了固氮草螺菌(Herbasprillium)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等固氮細(xì)菌。Laerua等[30]也報(bào)道了包括蕨狀滿(mǎn)江紅和小葉滿(mǎn)江紅在內(nèi)的地球上現(xiàn)存的7種滿(mǎn)江紅葉腔中均有根瘤菌(Rhizobium)存在, 但沒(méi)有說(shuō)明是否有其他固氮細(xì)菌或藍(lán)細(xì)菌被檢出。至于在用Nickell培養(yǎng)液培養(yǎng)的萍體樣品中nifH基因來(lái)自Pseudomonasstutzeri, 其潛在作用有待進(jìn)一步研究。

如上所述, 無(wú)藻滿(mǎn)江紅均未檢出固氮的Nostoc azollae以及固氮草螺菌(Herbasprillium)、Niveispirillum和根瘤菌(Rhizobium)等固氮細(xì)菌。由于缺乏這些原先可以提供結(jié)合態(tài)氮的微生物, 勢(shì)必顛覆無(wú)藻滿(mǎn)江紅及內(nèi)生細(xì)菌的氮代謝通路, 從而從根本上改變內(nèi)生細(xì)菌的群落構(gòu)成。由于內(nèi)源氮素基本被切斷, 其內(nèi)生菌種類(lèi)和數(shù)量的變化在所難免。

3.3 結(jié)合態(tài)氮對(duì)滿(mǎn)江紅表型結(jié)構(gòu)的影響

從形態(tài)學(xué)的角度來(lái)看, 結(jié)合態(tài)氮導(dǎo)致共生藻Nostoc azollae從滿(mǎn)江紅葉腔內(nèi)消失, 進(jìn)而使與Nostoc azollae共存的內(nèi)生菌數(shù)量種類(lèi)明顯減少, 未能形成生物被膜和藻囊。生物被膜(Biofilm)是多種微生物聚集并包埋在自身分泌的胞外高分子基質(zhì)(Extracellular polymeric substances, EPS)中的一種構(gòu)造, 其性質(zhì)完全不同于自由散在的微生物細(xì)胞群體[31]。本研究揭示的滿(mǎn)江紅葉腔中的生物被膜可能比一般所稱(chēng)的生物被膜更為復(fù)雜。因?yàn)槌怂{(lán)藻、細(xì)菌等微生物外, 它還包含真核宿主的腺毛細(xì)胞及其分泌物。這種生物被膜的形成和發(fā)生不僅有利于微生物自身的生長(zhǎng)繁衍和物質(zhì)、信息交換,也勢(shì)必對(duì)宿主滿(mǎn)江紅的生長(zhǎng)發(fā)育乃至抗逆等方面都會(huì)有正面的促進(jìn)作用。藻囊是迄今為止植物共生固氮體系中最為特殊的共生結(jié)構(gòu)。它作為腺毛、藍(lán)藻、細(xì)菌等多種微生物相互交織、互利互惠、可實(shí)現(xiàn)囊內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的相對(duì)獨(dú)立的實(shí)體結(jié)構(gòu), 又通過(guò)腺毛與宿主進(jìn)行物質(zhì)和信息交換, 形成錯(cuò)綜復(fù)雜的交互網(wǎng)絡(luò)。這是無(wú)藻滿(mǎn)江紅無(wú)可比擬的。所以含藻滿(mǎn)江紅個(gè)體比無(wú)藻滿(mǎn)江紅大且肥厚就不足為奇了。

總的來(lái)說(shuō), 結(jié)合態(tài)氮把Azolla-Nostoc azollae共生固氮體系還原為“純粹”的蕨體。原先互惠互利的碳氮代謝通路已不復(fù)存在。無(wú)藻滿(mǎn)江紅需要依賴(lài)外源結(jié)合態(tài)氮才能存活。從表觀上看, 無(wú)藻滿(mǎn)江紅個(gè)體變小了, 葉片因?yàn)槿鄙僭迥叶兊酶熬o湊”了, 甚至連葉表的乳頭狀突起也有某種程度的“修飾”。這啟示我們: 通過(guò)改變植物的共生伙伴和內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)有可能改變植物的表型和生存方式。深入探討和比較含藻滿(mǎn)江紅與無(wú)藻滿(mǎn)江紅的生長(zhǎng)速度、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及其影響因子的分子機(jī)制, 有望為作物增產(chǎn)和品質(zhì)改良提供新的線(xiàn)索和思路。