參苓護(hù)肝膠囊定性鑒別和芍藥苷含量測定方法的研究

段立廣 王東晗 安緋悅 閆 凱*

（1、河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 石家莊050000 2、河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院化學(xué)藥品檢驗室，河北 石家莊050000）

肝臟疾病誘發(fā)原因眾多，是一種常見的危害性極大的疾病。參苓護(hù)肝膠囊由白術(shù)、茯苓、白芍、赤芍等12 味藥材組成，膠囊內(nèi)容物棕褐色、粉末、味苦，具有健脾益氣疏肝、保肝護(hù)肝的功效。參苓護(hù)肝膠囊作為河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院的院內(nèi)制劑，在探索中醫(yī)藥學(xué)治療慢性肝病方面取得了良好的臨床療效。經(jīng)臨床觀察顯示，參苓護(hù)肝膠囊能降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），并能有效防止慢性肝病再次復(fù)發(fā)的危險。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)參苓護(hù)肝膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，本文建立了HPLC 法測定參苓護(hù)肝中芍藥苷含量的方法[1,2]，同時采用薄層色譜法對參苓護(hù)肝中白術(shù)、茯苓、白芍等成分進(jìn)行了定性鑒別[3-5]，為參苓護(hù)肝膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（PDA 檢測器，美國Agilent 公司）；超聲波清洗儀（KQ-500KDE，昆山市超聲儀器有限公司）；自動點樣儀（Linomat-5，CAMAG 公司）；萬分之一電子天平（AE240，上海梅特勒儀器有限公司）；超純水制備機（Millipore 公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：110736-201438，純度＞98%）、白術(shù)對照藥材（批號：120925-200708）、茯苓對照藥材（批號：121117-200504）均購自中國食品藥品檢定研究院。三批參苓護(hù)肝膠囊樣品來自河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，黨參、白術(shù)、茯苓、柴胡、木香、厚樸、當(dāng)歸、白芍、赤芍、法半夏、郁金、甘草經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中藥室郭俊利中藥師鑒定。乙腈（色譜純），水（超純水），其它試劑（分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 茯苓

稱取參苓護(hù)肝膠囊內(nèi)容物5g，置于圓底燒瓶中，向其中加入乙醚30ml，加熱回流提取30min，濾過，將濾液蒸發(fā)至干，加入1ml 甲醇溶液將殘渣溶解，作為供試品溶液。另取茯苓對照藥材，同供試品制備方法制備，作為對照藥材溶液。按處方比例制成不含茯苓藥材的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備沒有茯苓的陰性對照溶液。依照薄層色譜法（通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液以及陰性對照溶液各10μl，點于同一硅膠G 薄層板上，將石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照24：5：1 的比例配置成為混合溶液并用作展開劑使用，預(yù)飽和30min，展開，展距15cm，取出，晾干，置于紫外光燈365nm 波長下進(jìn)行檢視。如圖1 所示，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜中顯示有相同顏色的熒光斑點，而陰性對照色譜中沒有此類熒光干擾。

2.1.2 白術(shù)

圖1 茯苓薄層色譜鑒別結(jié)果

取參苓護(hù)肝膠囊內(nèi)容物5g，加正己烷30ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加1ml 正己烷溶液使溶解，作為供試品溶液。另取白術(shù)對照藥材，同法制備對照藥材溶液。按處方比例制成不含白術(shù)藥材的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備缺白術(shù)的陰性對照溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷- 異丙醇(50：1) 為展開劑，預(yù)飽和30min，展開，展距15cm，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照色譜無干擾，結(jié)果見圖2。

圖2 白術(shù)薄層色譜鑒別結(jié)果

2.1.3 白芍、赤芍

稱取參苓護(hù)肝膠囊內(nèi)容物5g，加入30 ml 無水乙醇，使用超聲處理30min，濾過，采用水浴加熱的方法將濾液蒸干，用20ml 蒸餾水將殘渣溶解，每次使用15ml 的乙醚將其萃取，連續(xù)萃取3 次，萃取完成后棄去乙醚層；水層用15ml 水飽和的正丁醇連續(xù)萃取3 次，萃取后合并正丁醇層并將其水浴蒸干，用1ml的乙醇將殘渣溶解，將其作為供試品溶液。另外稱取芍藥苷對照品少許，加乙醇配制成1mg/mL 的對照品溶液。按照處方比例，稱取除白芍和赤芍外的其他藥材，制備沒有白芍和赤芍的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制成沒有白芍和赤芍的陰性對照溶液。按照薄層色譜法（通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10μl，點于同一硅膠G 薄層板上。將氯仿、甲醇、甲酸按照20：5：1 的比例配置成為混合溶液并用作展開劑使用，預(yù)飽和30min，展開，展距15cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。如圖3所示，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，供試品色譜中顯示有相同顏色的斑點，而陰性對照色譜中沒有此類熒光干擾。

圖3 白芍、赤芍薄層色譜鑒別結(jié)果

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Accliam C18(5μm，4.6mm×250mm)；流動相：乙腈(A) -0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～7min，7%A→15%A；7～20min，15%A→30%A；檢測波長為230nm；流速：1.0ml·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μl；理論板數(shù)按芍藥苷峰計大于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加適量甲醇溶解并稀釋成濃度為0.785 mg·ml-1的對照品儲備液。精密量取芍藥苷儲備液2.0ml 置于50ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

取參苓護(hù)肝膠囊內(nèi)容物0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，加入15ml 甲醇，超聲提取2 次，每次30min（功率400W，頻率40kHz)，合并上清液，水浴蒸干，殘渣用20ml 蒸餾水溶解，用乙醚萃取3次，每次15ml，棄去乙醚層；水層用水飽和的正丁醇萃取3 次，每次15ml；合并正丁醇層，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至25ml 容量瓶中，即得供試品溶液，備用。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方比例及制備工藝，將藥材粉碎后，制成缺白芍和赤芍的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.2.5 專屬性

取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖4。結(jié)果供試品色譜與對照品色譜色譜峰保留時間一致，陰性樣品相同保留時間無色譜峰，不干擾測定，且待測成分與其他物質(zhì)分離良好。

圖4 供試品（A）、陰性樣品（B）、芍藥苷對照品（C）色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，配置成系列濃度的對照品溶液，分別吸取10μl 注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷線性方程Y=138.7X-3.966，r=0.9999，線性范圍0.01816～2.797μg，結(jié)果表明芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗

取參苓護(hù)肝樣品0.5g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，芍藥苷峰面積RSD 為0.81%。結(jié)果表明，儀器具有良好的精密度。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗

取參苓護(hù)肝樣品0.5g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，分別在0，3，6，9，12，15h 注入液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果芍藥苷峰面積RSD 為1.19%，表明供試品溶液在室溫條件下15h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗

取同一批參苓護(hù)肝膠囊樣品約0.25g、0.5g、0.75g 各三份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法平行制備9 份供試品溶液，測定含量。計算得芍藥苷的平均含量為3.6102mg·g-1，RSD 為2.11%，結(jié)果表明，本實驗方法重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗

取已知含量同一參苓護(hù)肝樣品0.25g，共9 份，精密稱定，每三份為一組，分別精密加入低、中、高三個濃度的芍藥苷對照品溶液5ml，按“2.2.3”項下方法配制成回收率供試品溶液，依次進(jìn)入液相色譜儀，測定回收率。芍藥苷的平均加樣回收率為101.47%，RSD 為2.52%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.2.11 樣品含量測定

取3 批參苓護(hù)肝樣品各0.5g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法平行配制供試品溶液各3 份，依照“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并用外標(biāo)法計算樣品中芍藥苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 參苓護(hù)肝樣品中芍藥苷含量（n=3）

3 討論

本實驗采用薄層色譜法對參苓護(hù)肝膠囊中茯苓[6]、白術(shù)[7-9]、白芍和赤芍[10-11]進(jìn)行了定性鑒別。在茯苓薄層鑒別實驗時，比較了乙醚和乙醇不同提取溶液，超聲和加熱回流不同提取方法對色譜斑點情況的影響。研究發(fā)現(xiàn)，乙醚加熱回流提取法的薄層色譜斑點清晰，圓整。同時比較了石油醚- 乙酸乙酯(4：1)，石油醚- 丙酮- 乙酸乙酯(84：15：1)，石油醚- 乙醚(3：2)，石油醚-乙酸乙酯- 甲酸(24：5：1)不同展開劑對色譜分離情況的影響，發(fā)現(xiàn)石油醚- 乙酸乙酯- 甲酸(24：5：1)作為展開劑時，分離較好，無邊緣效應(yīng)。

在HPLC 法測定芍藥苷含量的方法研究中[12-13]，對供試品提取液進(jìn)行了乙醚和水飽和正丁醇的多次萃取操作，這樣大大降低了其他物質(zhì)對芍藥苷色譜峰的干擾，使高效液相色譜基線更平穩(wěn)。并比較了乙腈- 水，甲醇- 水，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.1%冰乙酸水，乙腈-0.05%磷酸水等不同流動相梯度洗脫時峰的分離度和峰形，實驗發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水為流動相時峰的分離度與峰形較好。

本研究建立了薄層色譜法對參苓護(hù)肝膠囊中白術(shù)[14]、茯苓、白芍、赤芍定性鑒別的方法和HPLC 法測定參苓護(hù)肝中芍藥苷含量的方法，建立的薄層色譜法分離度好，專屬性強，操作簡便快捷，高效液相色譜法精密度高，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本實驗為參苓護(hù)肝膠囊的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。