雞CPT1A基因的生物信息學分析和組織表達譜構建

田慧慧，孫君衛(wèi)，馬向飛，郭玉潔，李東華，孫桂榮，康相濤，閆峰賓

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河南 鄭州 450002;2. 河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450002)

在細胞液中，肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)可以催化脂酰輔酶A與肉堿反應生成脂?；鈮A，脂酰基肉堿與載體結合以后會被轉(zhuǎn)運到線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，然后在肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶2(carnitine palmitoyl transferase 2,CPT2)的作用下，脂?；鈮A又與輔酶A作用釋放出肉堿，重新生成脂酰輔酶A[1]。因此，CPT1是脂酰輔酶A進入線粒體的關鍵酶，也是脂肪酸β氧化的限速酶[2～4]。CPT1有不同基因編碼的3種亞型：肝型CPT1A、肌肉型CPT1B和大腦型CPT1C[5]。其中，CPT1A富集于肝臟中，在真核生物的脂肪酸代謝過程中，CPT1A是長鏈脂肪酸從細胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移后進行氧化以提供能量的關鍵限速酶[6]。在體外培養(yǎng)的棕色脂肪細胞中，CPT1A被證實能提高脂肪酸的β-氧化和線粒體功能[7]。CPT1A的功能主要是在機體或組織缺乏能量時，催化脂肪酸進入線粒體進行氧化，維持血糖和能量供給的平衡[8]；主要參與脂肪酸的β-氧化，與肝臟脂肪酸氧化、骨骼肌能量攝取以及棕色脂肪產(chǎn)熱供能有關[9]。不同組織中的CPT1A活性不同，在肝臟中活性最高，氧化速率也最高[10]。與CPT1B和CPT1C相比，CPT1A能更高程度地調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸的氧化過程，影響機體正常生命活動，有著極其重要的作用[6]。

關于CPT1A的研究主要集中于哺乳動物，在禽類上研究相對較少。前人主要研究了綿羊、山羊、小鼠和豬等動物的CPT1A基因的生物信息學分析和組織表達譜構建，梁計峻等[5]指出CPT1A基因可能在山羊肌內(nèi)脂肪沉積過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，而禽類與哺乳動物的能量代謝調(diào)節(jié)有著諸多差異[11]，所以在哺乳動物上的研究結論可能并不適用于禽類。

本文通過Ensemble數(shù)據(jù)庫下載CPT1A基因的氨基酸序列并進行生物信息學分析，采用熒光定量PCR技術來檢測CPT1A基因在同一周期固始雞的腹脂、皮脂、胸肌、腿肌和肝臟及不同周期胸肌中的表達水平，旨在分析該基因表達水平的組織和時空差異，為后續(xù)研究該基因的功能以及該基因分子機制和雞脂肪沉積提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物組織樣品的采集

分別選取6周、12周、22周和30周健康固始雞各3只，將雞放血處死以后，無菌采集12周固始雞胸肌、腹脂、皮脂、腿肌、肝組織，以及6周、12周、22周和30周固始雞胸肌組織，迅速投入液氮中進行冷凍，之后置于-80 ℃保存以備使用。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TAKARA)、Trizol試劑(TAKARA)、氯仿、異丙醇和乙醇等。

1.3 生物信息學分析

利用Ensemble數(shù)據(jù)庫(http://www.ensembl.org/)查找并下載不同物種CPT1A基因的氨基酸序列；利用EXPASY在線工具中的ProtParam程序(https://web.expasy.org/protparam/)對雞CPT1A蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析；利用EXPASY在線工具中的ProtScale程序(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)分析蛋白的特性；利用SignalP 4.1 Server程序預測信號肽；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜結構域；利用SPOMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)和Phyre 2程序(https://sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分析蛋白的結構；利用SMART(http//:smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白的功能結構域、代謝通路并分析蛋白互作；利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 引物設計與合成

根據(jù)NCBI所提供的雞CPT1A基因及內(nèi)參β-actin基因的序列，使用BLAST-Primer在線軟件來設計熒光定量PCR所需引物，引物設計完成后由尚亞生物公司合成，引物信息見表1。

表1 熒光定量引物信息

1.5 總RNA的提取

RNA提取使用Trizol法，具體操作步驟如下：取50 mg左右冷凍組織樣品于無RNA酶離心管中，加入1 mL的Trizol和2～3顆經(jīng)消毒的研磨鋼珠，混勻后放入全自動樣品快速研磨儀中，50 Hz研磨90 s，重復3次后靜置5 min；加入200 μL氯仿并劇烈震蕩混勻，靜置至液體明顯分層，然后放入4 ℃離心機，設置轉(zhuǎn)速為12 000 r/min,離心15 min；將上清液吸取到一個新的無RNA酶EP管中，加入相同體積的異丙醇，倒置混合后靜置10 min；放入4 ℃離心機，以12 000 r/min的速度離心15 min；棄去上清液體后加入1 mL現(xiàn)配的75%酒精，上下顛倒并洗滌管壁，再按上述條件離心15 min；倒掉酒精保留白色沉淀，打開管蓋放置超凈工作臺風干后，加入適量無RNA酶水，溶解沉淀，待沉淀完全溶解后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用1 %瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性，并使用微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度及質(zhì)量。

1.6 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反轉(zhuǎn)錄反應采用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行，試劑盒中包含著去除基因組污染的相關試劑。試驗操作如下：取2 μL總RNA于離心管中，依次加入5 μL RNase Free dH2O、2 μL 5×gDNA Eraser Buffer和1 μL gDNA Eraser，混勻并震蕩離心后使用PCR儀設置42 ℃反應2 min；取上述反應液，再加入4 μL RNase Free dH2O、4 μL 5×Prime Script Buffer、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix1和1 μL RT Primer Mix, 混勻并震蕩離心后，將其放入PCR儀中，設置程序為37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s。合成的cDNA用無RNA酶水稀釋后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，以SYBR Green為染料，采用Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀進行反應，該反應平臺為Light Cycler?96 system系統(tǒng)，試驗結果和數(shù)據(jù)由該系統(tǒng)配套軟件進行收集和整理。每個樣品均進行3次技術重復和3個生物學重復。試驗操作簡述如下：實時熒光定量PCR擴增反應體系為10 μL，其中含有5 μL SYBR Green Mix，3 μL RNase Free dH2O，上、下游引物各0.5 μL和1 μL cDNA模板。反應程序如下：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)。72 ℃最終延伸10 min。實時熒光定量PCR采用相對定量方法，以雞β-actin基因為內(nèi)參基因，目的基因CPT1A的相對表達量按照2-ΔΔCt法進行計算分析，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt校正前-ΔCt校正后，相對表達量=2-ΔΔCt。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間顯著性差異分析使用單因素方差分析，選擇Duncan法檢驗，試驗數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標準差，顯著性水平設定為P<0.05。柱狀圖使用Graphpad Prism 7.0軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 雞CPT1A蛋白理化特性分析

ProtParam程序預測顯示，雞CPT1A蛋白分子式為C3971H6136N1058O1131S34，氨基酸的數(shù)量為770個，分子量為87 784 Da，理論等電點為8.62。其氨基酸組成中，丙氨酸所占比例最高為6.6 %(51個氨基酸)，帶負電荷的氨基酸總數(shù)為85個(天冬氨酸+谷氨酸)，帶正電荷的氨基酸總數(shù)為92個(精氨酸+賴氨酸)。不穩(wěn)定指數(shù)為39.25，說明該蛋白為穩(wěn)定性蛋白。脂肪系數(shù)為82.15，總平均親水性為-0.297。利用ProtScale程序在線分析雞CPT1A蛋白特性，結果見圖1A。標度值<0的區(qū)域比標度值>0的區(qū)域密集(標度值<0值表示親水性，標度值>0值表示疏水性)，結合上述總平均親水性為-0.297，所以可推斷該蛋白屬于親水性蛋白。Signal P 4.1程序預測顯示該蛋白沒有信號肽結構。經(jīng)TMHMM預測跨膜結構域，結果見圖1B。雞CPT1A蛋白有兩個跨膜結構域，分別位于雞CPT1A蛋白氨基酸序列的62到84位和104到126位，因此可知該蛋白是跨膜蛋白。

圖1 雞CPT1A蛋白親/疏水性和跨膜結構域分析

2.2 雞CPT1A蛋白結構預測分析

SPOMA預測結果見圖2A。雞CPT1A蛋白主要是由α-螺旋(49.48%)，β-折疊(5.19 %)，延伸鏈(11.56 %)和無規(guī)則卷曲(33.77 %)組成。通過Phyre 2預測該蛋白的三級結構結果見圖2B。

圖2 雞CPT1A蛋白二級結構和三級結構分析

2.3 雞CPT1A蛋白功能結構域、蛋白互作以及代謝通路預測分析

SMART分析雞CPT1A蛋白功能結構域，結果見圖3A。該蛋白在1～47和171～759氨基酸殘基處存在兩個保守性結構域。

蛋白互作圖見圖3B。雞CPT1A蛋白可能與長鏈脂酰輔酶A合成酶家族(ACSLs)、長鏈脂肪酸-輔酶A連接酶家族(ACSBGs)、CPT2以及脂酰輔酶A氧化酶1(ACOX1)存在相互作用；預測顯示該蛋白可能參與的代謝通路為脂肪酸代謝，PPAR信號通路和脂肪細胞因子信號通路。

圖3 雞CPT1A蛋白的功能結構域分析和蛋白互作分析

2.4 CPT1A基因系統(tǒng)進化樹的構建

選取了奶牛、山羊、豬、人、小鼠、雞和斑馬魚共7種典型動物，用Clustal W對下載好的各個物種的氨基酸序列進行多序列比對后，利用MEGA 6.0軟件，采用NJ(Neighbor-joining)法自晨分析(Bootstrap)1 000次，構建不同物種CPT1A基因的系統(tǒng)進化樹，結果見圖4。雞與斑馬魚CPT1A基因的親緣關系最遠，與小鼠、人、豬、山羊、奶牛的親緣關系較近。

圖4 CPT1A基因系統(tǒng)進化樹分析

2.5 CPT1A基因在12周固始雞不同組織中的表達

利用實時熒光定量PCR技術，對CPT1A基因在12周固始雞的腹脂、皮脂、胸肌、腿肌、肝臟共5個組織中的表達情況進行比較分析，結果見圖5。CPT1A基因在12周固始雞的5個組織中均有表達，在肝臟中表達水平最高，且顯著高于其余4個組織(P<0.05)。在胸肌和腿肌中表達水平次之，在腹脂和皮脂中表達量較低，且在這4個組織中表達水平差異不顯著(P>0.05)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.6 CPT1A基因在不同時期發(fā)育階段固始雞胸肌中的表達

采用實時熒光定量PCR技術來分析CPT1A基因在固始雞胸肌中的表達情況。由圖6可知，CPT1A基因的表達水平在不同時期發(fā)育階段固始雞的胸肌中存在一定差異。CPT1A基因在12周和6周固始雞的胸肌中表達量相對較高，30周則表達量最低，且6周和12周表達水平顯著高于22周和30周表達水平(P<0.05)。

圖6 CPT1A基因在不同時期固始雞胸肌中的差異表達

3 討論

CPT1A基因主要定位于線粒體外膜,負責轉(zhuǎn)運細胞漿中的游離脂肪酸至線粒體內(nèi),進而促進脂肪酸后續(xù)的酸氧化[12]，是真核生物體內(nèi)脂肪酸β-氧化的限速酶，對機體的脂肪代謝調(diào)控具有重要作用[13]。Bruce等[14]發(fā)現(xiàn)，增強CPT1A活性或提高CPT1A表達量均可促進脂肪酸β-氧化。一項在肥胖小鼠及瘦鼠的體內(nèi)試驗也表明，CPT1A表達增加可降低肝臟甘油三酯的含量[15]，因此可以通過提高該基因的表達來加快脂肪酸氧化，進而改善代謝紊亂，及時進行能量補給，從而調(diào)節(jié)機體的能量代謝平衡[9]。越來越多的研究證明，CPT1A基因?qū)τ趧游餀C體的能量代謝和脂肪沉積發(fā)揮著重要作用，對于該基因的研究主要集中在哺乳動物上，在禽類上研究相對較少。

通過生物信息學軟件對該基因的序列進行分析和功能預測，結果顯示：雞CPT1A蛋白為穩(wěn)定性蛋白，親水性強，無信號肽，有兩個跨膜結構域，屬于跨膜蛋白，有兩個保守性結構域，與長鏈脂酰輔酶A合成酶家族(ACSLs)、長鏈脂肪酸-輔酶A連接酶家族(ACSBGs)、CPT2以及脂酰輔酶A氧化酶1(ACOX1)存在相互作用，該預測結果與梁計峻[5]在山羊上的預測結果較一致。本研究通過實時熒光定量PCR技術來分析該基因在雞各組織中的表達情況，結果顯示，CPT1A基因在雞的腹脂、皮脂、胸肌、腿肌和肝中均有表達，可以得知該基因在雞體內(nèi)廣泛表達，且組織表達模式存在差異，該結果與他人在羊上的研究結果較一致[1,16]。豬上的研究也表明，該基因在多種組織中均有表達，是一個廣泛表達的基因，且在肝臟中表達量最高[17]。該基因在肝臟中表達量最高可能是因為肉堿主要在肝臟中合成，所以該基因作為肉堿的轉(zhuǎn)運基因在肝臟中高表達。

本研究還分析了CPT1A基因在不同周齡固始雞胸肌中的表達情況。結果顯示，在不同發(fā)育階段固始雞的胸肌中，CPT1A基因呈現(xiàn)出不同的表達量，12周和6周表達量相對較高，其次是22周，30周表達量則最低，不同時期該基因的差異表達可能是因為機體在不同時期脂代謝能力有所差異。Bartelds等[18]發(fā)現(xiàn)，CPT1A基因在羔羊出生后表達量有所增加，可能是因為該基因的表達與機體生長發(fā)育階段有關，有待于進一步研究CPT1A基因在分化過程中不同階段的功能。任陽等[19]在檢測金華豬與長白豬CPT1基因mRNA的組織分布時，發(fā)現(xiàn)品種間也存在差異現(xiàn)象，本文后期打算進行品種間的差異檢測。該基因在雞不同組織中、不同時期胸肌中的表達存在差異的機制目前尚不清楚，有待于進一步深入研究。有研究表明CPT1A基因與雞的胸肌脂肪酸氧化相關，并影響肌內(nèi)脂肪的含量[20]，其表達水平與體脂肪的含量有關[21]。本研究表明雞CPT1A基因具有組織和時空差異性，該試驗結果為進一步研究該基因的功能以及該基因與雞脂肪沉積、生長發(fā)育的關系提供了一定的理論基礎。