牛呼吸道合胞體病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立

韋佳塔，侯廣爭，伍鋼，張玉雪，陳海蘭*，劉琪琦*

(1. 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2. 軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

牛呼吸道合胞體病是由牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)感染引起的養(yǎng)牛業(yè)面臨的嚴重疾病，可造成巨大的經濟損失[1]。病毒、細菌和支原體感染，以及應激和環(huán)境因素，如斷奶、溫度、放養(yǎng)密度、粉塵、濕度、運輸和營養(yǎng)不良都可以引起牛呼吸道合胞體病的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。BRSV感染后可導致永久性肺損傷，使病畜更容易出現(xiàn)呼吸道癥狀，還可以促進機會性繼發(fā)性病原體的侵襲，如溶血性鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌和一些支原體物種，對動物的生產性能造成長期的影響，嚴重損害動物的生長速度和養(yǎng)殖戶的經濟回報[4]。因此，在感染BRSV的養(yǎng)殖場，由于死亡損失、生產和生長性能下降以及疫苗和治療的費用，每年所造成的經濟損失接近10億美元[5]。

BRSV是一種有囊膜的單股負鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科肺病毒屬，在世界范圍內流行，是牛呼吸道疾病的主要病原體之一。牛呼吸道合胞體病曾在比利時、荷蘭和比利時等國發(fā)生暴發(fā)，抗體陽性率可達80%，死亡率超過20%；美國、丹麥、墨西哥等國的BRSV抗體陽性率均高于50%。我國養(yǎng)牛省份BRSV抗體平均陽性率則高達69.6%，其中內蒙古抗體陽性率最高可達92.8%，位居國內各省首位，吉林、山西、河南、遼寧和廣西等省份抗體陽性率也高達70%以上，就連抗體陽性率最低的江西省也達到了41.28%[6-7]。BRSV的檢測方法主要包括牛胚胎腎細胞(bovine embryonic kidney cells，BEK)分離培養(yǎng)[4]、酶聯(lián)免疫吸附試驗[8]和普通PCR方法[9]，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)對生物安全性要求低，可實現(xiàn)BRSV快速檢測，目前已逐步成為BRSV感染快速檢測的主要方法之一[10]。為規(guī)范RT-qPCR的試驗操作流程，確保檢測結果準確有效，本研究參考標準物質的研制方法[11]，根據(jù)BRSV核酸檢測的全基因組保守序列N基因片段，采用克隆技術和體外轉錄的方法，制備出BRSV核酸檢測的參考品，并借助數(shù)字PCR進行聯(lián)合定值和不確定度分析。此外，使用該參考品作為模板，設計并篩選了引物和探針，通過對擴增體系各項條件進行優(yōu)化，建立了BRSV RT-qPCR快速檢測方法，并對其特異性、敏感性及準確性進行評價。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

牛呼吸道合胞體病毒VR-1485株、牛副流感病毒3型(bovine para influenza virus 3，BPIV 3)購自美國標準生物品收藏中心，牛病毒性腹瀉病毒1型(bovine viral diarrhea virus 1, BVDV1)購自北京華威特生物科技有限公司，口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)O型沒活疫苗購自中牧實業(yè)股份有限公司，小反芻獸疫病毒(pestedes petits ruminants virus，PPRV)弱毒疫苗購自新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)Bartha-Nu/67株、絲狀支原體絲狀亞種SC型(mycoplasma mycoides subsp mycoides SC, MmmSC)PG1標準株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，藍舌病毒(bluetongue virus，BTV)血清型10、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)印第安納株由本實驗室保提供和保存。

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒購自Invitrogen公司，體外轉錄試劑盒Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7購自Promega公司，Neoscript RT Premix(Probe qRT-PCR)購自珠海寶銳生物科技有限公司，Premix Ex TaqTM、pBM20S Toposmart克隆試劑盒、Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit反轉錄試劑盒、Mini BEST Plasmid Purification、DNA Fragment Purification Kit均購自TaKaRa公司。

1.3 核酸提取

利用核酸自動提取儀對疫苗及樣品的病毒核酸進行提取。在1.5 mL無RNase離心管中加入10 μL Proteinase K、4 μL Acryl Carrier、300 μL Lysis Buffer、20 μL磁珠，將疫苗、病毒或菌株樣品稀釋處理后，取200 μL加入上述核酸提取體系，震蕩混勻離心管，室溫下顛倒混勻10 min，使磁珠和核酸充分結合。將離心管放在磁力架上1 min，待磁珠被吸附到底部后，棄去管內液體。取下離心管，加入500 μL Wash Buffer Ⅰ，使磁珠重新懸浮，并將離心管置于磁力架上，吸磁1 min后棄去管內液體。然后取下離心管，加入500 μL Wash Buffer Ⅱ，使磁珠重新懸浮，將離心管放在磁力架上，吸磁1 min后，棄去管內液體，離心管仍置于磁力架上，使磁珠繼續(xù)被吸附。接著將550 μL Wash Buffer Ⅲ加入離心管，盡量不要沖起磁珠，1 min后棄去管內液體。取下離心管，加入80 μL Elution Buffer，磁珠重新懸浮，55 ℃水浴5 min，其間輕輕晃動離心管2次，充分洗脫核酸。最后，將離心管放在磁力架上，1 min后將液體轉移至新的1.5 mL無RNase離心管，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BRSV核衣殼(N)蛋白基因的擴增、克隆和序列分析

對BRSV-N基因序列進行多重比對，設計并篩選出一對引物(表1)用于特異性擴增BRSV-N基因序列，預期片段長度為224 bp。提取BRSV的完整基因組核酸，再以其作為模板，采取RT-PCR擴增N基因的保守序列。擴增程序參數(shù)為50 ℃ 20 min，95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s，35 個循環(huán)。將回收純化后的BRSV目的片段克隆于pGEM-T載體，并轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，構建重組質粒DH5α-N，測序鑒定。

表1 引物序列

1.5 體外轉錄病毒RNA制備BRSV參考品

利用限制性內切酶SmalⅠ對DH5α-N重組質粒線性化，通過T7反轉錄試劑盒對線性化的質粒進行體外轉錄，用DNA酶消除體系中的DNA模板，再重新用TRIzol提取體系中RNA，以去除溶液中的各種雜蛋白和離子，即獲得RNA純品。將RNA純品稀釋500倍，通過超微量光譜儀測量其OD260和OD280，再將RNA純品梯度稀釋10-6～10-9，最后將10-9對半稀釋至5-10，利用篩選好的引物探針結合伯樂QX-200數(shù)字PCR儀，計算RNA拷貝數(shù)。利用RNA穩(wěn)定儲存液將cRNA稀釋至1011拷貝數(shù)/mL，然后分裝保存。

1.6 BRSV RT-qPCR方法的建立和優(yōu)化

根據(jù)GenBank上收錄的牛呼吸道合胞體病毒完整基因組(MG947594.1)中最保守的N基因，通過DNA star軟件進行多重比對分析，選取保守序列利用Primer Express 3.0.1設計和篩選出一對特異性引物探針(表2)，建立BRSV的RT-qPCR快速檢測方法。引物和探針均由北京擎科生物科技有限公司合成。再以制備的BRSV參考品cRNA當作模板，通過上述引物探針進行RT-qPCR方法的優(yōu)化，找到最佳擴增條件及擴增體系，主要有Buffer濃度、引物探針濃度以及反應程序參數(shù)等。

表2 引物序列

1.7 特異性試驗

利用建立的方法對BRSV、BPIV、PPRV、IBRV、BTV、CBPP、VSV、FMDV和BVDV等病毒核酸同時進行檢測，以驗證該方法的特異性。

1.8 靈敏度試驗

將純化后的BRSV-N cRNA參考品梯度稀釋至103～108拷貝數(shù)/mL后，通過上述優(yōu)化好的BRSV RT-qPCR體系進行檢測，并以無菌水當作陰性對照，根據(jù)試驗結果，來確定該方法的最低檢測限，并繪制相應的標準曲線。

1.9 重復性試驗

隨機抽取同一批次3個不同梯度的BRSV-N cRNA參考品各3管，同時采取BRSV RT-qPCR快速檢測方法進行檢測，計算組內變異系數(shù)；再隨機抽取不同批次3個不同梯度的BRSV-N cRNA參考品當作模板，利用建立的BRSV RT-qPCR快速檢測方法重復檢測3次，計算組間變異系數(shù)，以評價該方法的重復性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣本檢測驗證

利用建立的RT-qPCR方法和普通PCR方法對實驗室之前收集的已知背景的35份牛鼻拭子臨床樣本進行檢測，比較兩種方法的檢測結果。并將判定為陽性的樣本測序結果進行BLAST分析。

2 結果

2.1 BRSV-N基因的擴增、克隆和測序

提取儲存在實驗室的BRSV基因組，并逆轉錄制備其cDNA當作模板使用，利用F1/R1引物通過PCR擴增BRSV-N基因。瓊脂電泳圖顯示，PCR擴增的基因片段大小約224 bp，與預期符合(圖1)。將擴增產物進行回收純化后，克隆到DH5α感受態(tài)細胞中，構建重組質粒DH5α-N，將測序結果在NCBI上與參考序列進行同源性比對。結果顯示，兩者同源性為100%，進一步表明BRSV的目標片段序列與克隆載體pGEM-T已成功連接，可將該重組質粒作為TaqMan熒光PCR的模板。

M. Marker; 1. BRSV-N基因的cDNA模板PCR產物

2.2 BRSVcRNA參考品的制備與定值

重組質粒DH5α-N經SmalⅠ酶切后，通過T7反轉錄試劑盒對線性化的質粒進行體外轉錄獲得cRNA，再將cRNA用無RNA酶滅菌水500倍稀釋，測量其OD260和OD280。結果顯示，OD260和OD280的比值均在1.9～2.0之間，說明RNA純度高。再將RNA純品梯度稀釋10-6～10-9倍，最后將稀釋度10-9RNA對半稀釋至5-10，利用篩選好的引物探針，經伯樂QX-200數(shù)字PCR儀聯(lián)合定值后，計算得到參考品濃度為(1.11±0.04)×1011拷貝數(shù)/mL(圖2)，利用RNA穩(wěn)定儲存液將cRNA稀釋至1011拷貝數(shù)/mL，最后分裝成0.5 mL/管，并置于-80 ℃冰箱中保存。

A01. 陰性對照；G01. BRSV(5-10)；B02. BRSV(10-9)；D02. BRSV(10-8)；E02. BRSV(10-7)；F02. BRSV(10-6)

2.3 BRSV RT-qPCR檢測方法的建立和反應條件優(yōu)化

用已制備的BRSV-N參考品cRNA為擴增模板，優(yōu)化RT-qPCR的各項擴增條件。經過重復性試驗，確定BRSV RT-qPCR的最佳反應體積為25 μL，其中RNA模板3 μL；上下游引物的最佳濃度均為0.8 μmol/L，探針濃度為0.12 μmol/L，Mg2+濃度為3 mmol/L；最適反應條件為50 ℃ 20 min、95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、50 ℃ 30 s，40個循環(huán)；每個循環(huán)50 ℃結束時采集熒光。

2.4 特異性試驗

采用建立的BRSV RT-qPCR方法，對BRSV核酸以及上述8種反芻動物病原核酸進行檢測。結果顯示，所建立的方法能夠快速準確地檢測出BRSV的核酸，而不與另外8種反芻動物病原核酸發(fā)生非特異性擴增(圖3)，表明該方法特異性高、通用性好。

2.5 靈敏度試驗

將已制備的BRSV-N cRNA參考品梯度稀釋至103～108拷貝數(shù)/mL后，通過上述優(yōu)化好的BRSV RT-qPCR體系進行檢測，并將無菌水作為陰性對照，得到的最低檢測限可達104拷貝數(shù)/mL(圖4)。

1. BRSV；2～9. BPIV, IBRV, BVDV, BTV, CBPP, VSV, PPRV, FMDV；10. 陰性對照

1～6. BRSV-N cRNA 103～108倍稀釋后的熒光擴增曲線；7. 陰性對照

依據(jù)圖4檢測極限的結果，利用宏石qPCR儀自帶的分析軟件對循環(huán)閾值(Ct值)和參考品中cRNA濃度進行線性回歸分析，繪制標準曲線(圖5)。結果顯示，參考品cRNA濃度與試驗所得Ct值呈良好線性關系，y=44.154-3.912x，R2>0.999，表明所建方法可用于BRSV核酸的定量。

圖5 BRSV RT-qPCR標準曲線

2.6 重復性試驗

組內變異系數(shù)和組間變異系數(shù)結果表明，兩者變異系數(shù)都小于2%(表3)，說明制備的參考品重復性和穩(wěn)定性較好。

表3 RT-qPCR重復性試驗結果

2.7 臨床樣本的檢測

收集實驗室保存的已知背景的病料共計35份臨床樣本，分別使用上述建立的RT-qPCR快速檢測方法與普通PCR方法進行檢測。結果顯示，普通PCR能夠檢出11份臨床樣本為陽性，而本方法能夠檢測出12份臨床樣本為陽性，并且與基因測序的檢測結果一致(表4)。將上步判定為陽性的臨床樣本測序結果進行BLAST分析，結果表明，測序結果與參考序列(MG947594.1)一致，確定為BRSV-N基因序列。

表4 臨床樣本的檢測結果 份

3 討論

BRSV在世界范圍內引起多種牛呼吸道疾病，特別是在犢牛肺炎的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。此外，BRSV感染可使犢牛容易受到溶血性鏈球菌、多殺性巴氏桿菌和嗜血桿菌等微生物的繼發(fā)性感染，從而增加牛呼吸道疾病的復雜性，是導致飼育牛高發(fā)病率和死亡率的重要因素[12]。即使在動物沒有死于牛呼吸道疾病的情況下，對生產性能也會有長期的損害。因此，建立一種快速、高效、特異性強的檢測方法對我國BRSV感染的防治具有重要的意義。

目前，盡管病毒分離被認為是鑒定BRSV的金標準測試，但該檢測方法所需時間較長，通常為3～4周[13]。運輸過程中病料內的病毒不穩(wěn)定，引起感染程度下降和感染力減弱，常導致檢出率低于實際水平。另外，該方法對實驗室的標準要求非常嚴格，不適合樣本量大且復雜的基層使用[14]。酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種快速、靈敏、高效的血清學診斷技術，因而被廣泛應用于該病的診斷[15]。雖然該檢測方法可以快速得到結果，但目前少有直接檢測病原的ELISA試劑，在某些情況下無法達到檢測要求，作為常規(guī)診斷適用性有限[16]。傳統(tǒng)PCR多為定性試驗，產物經電泳后才能在紫外凝膠成像儀中觀察到目的條帶，結果無法定量且實驗時間較長[17]。RT-qPCR是以傳統(tǒng)PCR為基礎發(fā)展起來的一種新型核酸檢測技術，能快速鑒定感染動物及其產品中的BRSV，目前已被逐漸作為該病的快速診斷和檢測的主要手段[18]。但是現(xiàn)有的大部分BRSV核酸檢測產品中缺少核酸參考品，對樣本中病毒的相對定量也缺乏準確依據(jù)。因此，我們首先通過反轉錄方法制備了BRSV的cRNA參考品，并對參考品的穩(wěn)定性和重復性進行了驗證，采用數(shù)字PCR方法對參考品的濃度進行了定量，在進行臨床樣本檢測時，可利用該參考品繪制的標準曲線對樣本中的BRSV含量進行準確定量，為制定個性化的治療方案和防控策略提供依據(jù)。

N基因是BRSV最保守的序列[19]，本研究以其作為BRSV核酸檢測的目標基因，通過基因克隆和體外轉錄制備了含有N基因片段的cRNA參考品，該參考品不具有感染性。組內和組間重復性的檢測結果變異系數(shù)均小于2%，定值結果為(1.11±0.04)×1011拷貝數(shù)/mL，可用作陽性參考品。此外，應用本研究制備的BRSV RNA參考品為模板，同時利用設計合成的BRSV引物探針，通過優(yōu)化RT-qPCR的各項擴增條件，建立了BRSV RT-qPCR快速檢測方法。應用優(yōu)化后的方法對制備的BRSV參考品進行檢測，檢測極限可達104拷貝數(shù)/mL病毒核酸。采用建立的方法和普通PCR方法對35份臨床樣本及其他相關病毒核酸進行檢測，結果顯示普通PCR能夠檢出11份臨床樣本為陽性，而本方法能夠檢測出12份臨床樣本為陽性，且與基因測序結果一致，表明本研究所建立的RT-qPCR方法比普通PCR方法更為靈敏，能夠滿足BRSV臨床檢測的要求，可有效避免在臨床檢測中由于病毒載量低而發(fā)生的漏檢。同時，本研究建立的RT-qPCR方法，檢測不到另外8種反芻動物病原核酸，說明該方法具有較高特異性?？傊?，本研究方法的建立為我國BRSV的快速檢測提供了物質基礎。