響應(yīng)面法優(yōu)化酸棗仁苦蕎酸奶發(fā)酵工藝

李華，倪娜，趙汝，王華

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)，內(nèi)蒙古通遼028000）

0 引 言

酸棗仁，是鼠李科植物酸棗經(jīng)干燥后的成熟種子，富含油性物質(zhì)氣味微淡[1-2]。近年很多學(xué)者研究認(rèn)為黃酮類物質(zhì)是酸棗仁中重要的活性物質(zhì)之一，其具有抗氧化、鎮(zhèn)靜催眠等多種功效[3-4]。 苦蕎，蓼科作物，苦蕎中含有豐富的黃酮類等化合物，使它不僅可以降血糖、降血脂，同時(shí)還具有清除自由基、抗菌、抗癌等功效[5-8]。

本研究對(duì)酸棗仁、苦蕎進(jìn)行預(yù)處理后將其用于酸奶發(fā)酵中，使產(chǎn)品除具有酸奶本身維持腸道菌群健康、提高免疫力等保健功能外，還具有清除自由基、抗氧化等保健功能，以迎合現(xiàn)代消費(fèi)者對(duì)風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)及保健功能完美結(jié)合的需求。此外，產(chǎn)品的研發(fā)也體現(xiàn)了藥食同源資源在食品中的綜合利用，同時(shí)為酸奶產(chǎn)品多樣化及功能性酸奶市場(chǎng)的擴(kuò)大提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

酸棗仁（生），市售；苦蕎，市售；牛奶，市售；蔗糖，市售；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus Bugarska）、嗜熱鏈球菌（Termofilski Streptococcus）為內(nèi)蒙古民族大學(xué)食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室提供。

乙醇（95%），磷酸（98%），無(wú)水乙醇，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁均為AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠；蘆丁，南京奧多福尼生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白，BSA Bovine Serum；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法)，Beyotime。

1.2 儀器設(shè)備

高速多功能搖擺粉碎機(jī)（XTP-500A），浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9203A），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-5500PC），上海元析儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TGL-16M），長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 工藝流程

1.3 操作要點(diǎn)

1.3.1 酸棗仁苦蕎漿的制備

用高速粉碎機(jī)將酸棗仁進(jìn)行粉碎后過(guò)60 目篩，與水按1∶7 混合后煎煮1.5 h，冷卻后過(guò)濾，濾液備用?？嗍w發(fā)芽后以嫩莖、嫩葉為原料，經(jīng)干燥、粉碎后過(guò)60目篩，與水按1∶5 混合后糊化酶解得苦蕎漿。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將二者以2∶1 的比例混合均勻，4 ℃貯藏備用。

1.3.2 菌種馴化

將均質(zhì)后的鮮牛奶冷卻至42 ℃左右，按照鮮牛奶∶乳酸菌（Lactobncillus bulgaricus∶Streptococcus thermophilus=1∶1)的接菌量為150 mL∶1 g的比例添加乳酸菌，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)42 ℃，發(fā)酵7 h后4 ℃ 冷藏，留以備用[9]。

1.3.3 配料混勻

將均質(zhì)后的牛奶和酸棗仁苦蕎漿混合均勻，按比例加入白砂糖，冷卻溫度至42 ℃左右接馴化后的菌種，充分?jǐn)嚢琛?/p>

1.4 酸棗仁苦蕎酸奶感官評(píng)定

根據(jù)GB19302-2010（食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳）[10]設(shè)計(jì)酸棗仁苦蕎酸奶的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（百分計(jì)）如表1 所示。由15 名人員（無(wú)感冒，身體狀態(tài)良好，無(wú)不良嗜好）組成感官評(píng)定小組，將適量的酸奶盛裝于容器中，在光線充足的環(huán)境下觀察酸棗仁苦蕎酸奶顏色，聞酸奶的氣味，然后用純凈水多次漱口，最后品嘗滋味，根據(jù)表1 對(duì)編號(hào)的樣品進(jìn)行感官評(píng)分，求其平均值作為最終得分并記錄。

1.5 酸棗仁苦蕎酸奶中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

根據(jù)食品中總黃酮的測(cè)定分光光度法（SZDB/Z 349-2019）[11]配制標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品，使用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)λ為510 nm），分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品的吸光度值A(chǔ)，以黃酮濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度A 為縱坐標(biāo)制作黃酮標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并得到回歸方程，代入黃酮計(jì)算式（1）計(jì)算得出酸棗仁苦蕎酸奶中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即

式中：ω為黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/100g）；m1為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的黃酮質(zhì)量（mg）；V 為試樣的提取體積（mL）；V1為吸取試樣的體積（mL）；M 為試樣的質(zhì)量（g）。

1.6 產(chǎn)品理化及微生物指標(biāo)測(cè)定方法

酸度的測(cè)定按GB5009.239-2016 中的酸度滴定法執(zhí)行[12]；

蛋白質(zhì)的測(cè)定按GB 5009.5-2010 中的凱氏定氮法執(zhí)行[13]；

脂肪的測(cè)定按GB 5413.3-2010 中蓋勃氏法測(cè)定脂肪含量[14]。

同時(shí)采用試劑盒測(cè)定產(chǎn)品的總抗氧化活性，并以市售普通酸奶做比較。

1.7 酸棗仁苦蕎酸奶單因素發(fā)酵工藝優(yōu)化

本研究對(duì)影響酸棗仁苦蕎酸奶品質(zhì)的4 個(gè)發(fā)酵工藝參數(shù)白砂糖添加量、乳酸菌接菌量、酸棗仁苦蕎漿添加量及發(fā)酵時(shí)間分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)變量研究。分別考察白砂糖添加量（7%，8%，9%，10%，11%）；乳酸菌接菌量（2%，3%，4%，5%，6%）；酸棗仁苦蕎漿添加量（10%，15%，20%，25%，30%）和發(fā)酵時(shí)間（5，6，7，8，9 h）對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶品質(zhì)的影響，并經(jīng)感官評(píng)定以確定各單因素的最佳參數(shù)。

1.8 響應(yīng)面法優(yōu)化酸棗仁苦蕎酸奶發(fā)酵工藝

根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法分別分析酸棗仁苦蕎酸奶發(fā)酵工藝條件與產(chǎn)品感官品質(zhì)之間的關(guān)系，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平如表2所示。

表1 酸棗仁苦蕎酸奶評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 白砂糖不同添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

白砂糖在酸奶中即可以影響酸奶的甜度調(diào)節(jié)改善酸奶風(fēng)味同時(shí)也影響乳酸菌的發(fā)酵，適宜的添加量可以促進(jìn)乳酸菌的發(fā)酵，添加量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制乳酸菌的發(fā)酵[15-16]。取適量均質(zhì)后的牛奶，添加4%馴化后的乳酸菌接菌和15%的酸棗仁苦蕎漿，再分別以7%，8%，9%，10%，11%的添加量添加白砂糖，混合均勻經(jīng)42 ℃發(fā)酵7 h 后4 ℃后熟得產(chǎn)品，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 白砂糖添加量對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶品質(zhì)的影響

由圖1 可以看出，當(dāng)白砂糖添加量由6%到10%時(shí)，感官評(píng)分值先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)白砂糖的添加量為9%時(shí)，感官評(píng)分值最高可達(dá)84.8，酸度為72.2 °T，此時(shí)口感柔和細(xì)膩，酸甜適中，故白砂糖的最佳添加量為9%。

2.2 酸棗仁苦蕎漿不同添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

添加4%馴化后的乳酸菌和質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的白砂糖，再分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，15%，20%，25%，30%的添加量添加酸棗仁苦蕎漿，混合均勻經(jīng)42 ℃發(fā)酵7 h 后4 ℃后熟得產(chǎn)品，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 酸棗仁苦蕎漿添加量對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶品質(zhì)的影響

由圖2 可知，預(yù)處理后的酸棗仁苦蕎漿的顏色為藕荷色，酸棗仁苦蕎漿的添加量在10%～25%范圍時(shí)會(huì)影響酸奶的風(fēng)味和色澤。酸棗仁苦蕎漿的添加量較少時(shí)，酸奶會(huì)呈現(xiàn)其本身的顏色，且產(chǎn)品只有奶香而不具有酸棗仁的典型芳香氣味和苦蕎的麥香；酸棗仁苦蕎漿添加較高時(shí)，會(huì)抑制乳酸菌的發(fā)酵，使發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，且酸奶顏色較深且酸棗仁的味道完全掩蓋了酸奶本身的風(fēng)味。因此，當(dāng)添加酸棗仁苦蕎漿的量在20%時(shí)感官評(píng)分最高，可達(dá)85.5 分，牛奶酸度76°T，此時(shí)酸奶呈現(xiàn)出淡藕荷色，有奶香、酸棗仁的芳香和苦蕎的麥香，口感細(xì)膩，酸甜較適口，無(wú)乳清析出。

2.3 乳酸菌不同接菌量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

酸奶發(fā)酵生產(chǎn)中，嗜熱鏈球菌（Termofilski Streptococcus）有利于提高酸奶酸度，縮短發(fā)酵時(shí)間；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus Bugarska）發(fā)酵產(chǎn)物影響酸奶的風(fēng)味[17]。在發(fā)酵過(guò)程中黃酮可能會(huì)影響乳酸菌的發(fā)酵，在發(fā)酵初期黃酮溶出速度較快，為避免黃酮類物質(zhì)對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響故本試驗(yàn)將二種菌種以1∶1 比例進(jìn)行復(fù)合[18-19]。復(fù)合菌種接菌量較大或較小對(duì)酸奶發(fā)酵及產(chǎn)品感官都是非常不利的，接菌量較大會(huì)導(dǎo)致酸奶發(fā)酵速度過(guò)快，產(chǎn)酸較多，酸甜感不協(xié)調(diào)，且后熟過(guò)程中乳清析出較多；接菌量太少，酸奶發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，產(chǎn)酸不足的同時(shí)也會(huì)使酸奶產(chǎn)生異味。取適量均質(zhì)后的牛奶添加9%白砂糖和20%酸棗仁苦蕎漿，分別以2%、3%、4%、5%、6%的接菌量接菌，混合均勻經(jīng)42 ℃發(fā)酵7 h 后4 ℃后熟得產(chǎn)品，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 乳酸菌接菌量對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶品質(zhì)的影響

由圖3 可知，當(dāng)接菌量在2%～6%時(shí)，感官評(píng)分呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)，與此同時(shí)隨著接菌量的增大酸奶酸度呈增大的趨勢(shì)。綜合感官評(píng)分和酸度，確定酸棗仁苦蕎酸奶的乳酸菌最佳接菌量為4%，此時(shí)感官評(píng)分為87.2 分，酸度為78 °T，產(chǎn)品組織細(xì)膩呈淡藕荷色，具有奶香、酸棗仁的芳香和苦蕎的麥香，口感酸甜適中，且無(wú)乳清析出。

2.4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

酸奶發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程中各類生物化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生程度進(jìn)而影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)。取適量均質(zhì)后的牛奶添加9%白砂糖和20%酸棗仁苦蕎漿，以4%接菌量接菌，混合均勻經(jīng)42 ℃分別發(fā)酵5，6，7，8，9 h 后4 ℃后熟得產(chǎn)品，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，其結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶品質(zhì)的影響

由圖4 可知，感官評(píng)分會(huì)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間在5～7 h 時(shí)，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)酵越充分，質(zhì)地就越均勻，口感細(xì)膩柔和，當(dāng)發(fā)酵7 h 時(shí)感官評(píng)分最高可達(dá)90.7 分，酸度為80 °T；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于7 h 后，酸奶的口感就會(huì)有所下降，口感較為細(xì)膩，酸度大于80 °T，此時(shí)酸奶口感較酸，且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)酸度越來(lái)越大，酸甜比例失調(diào)。因此當(dāng)發(fā)酵7 h 時(shí)，酸棗仁苦蕎酸奶質(zhì)地均勻，潤(rùn)滑爽口，酸甜感最佳，具有獨(dú)特的酸棗仁芳香和苦蕎的麥香。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化酸棗仁苦蕎酸奶發(fā)酵工藝

2.5.1 優(yōu)化發(fā)酵工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)及方差分析

通過(guò)Design-Expert8.0 軟件進(jìn)行表2 二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：

Y=-718.34167 + 84.82A + 61.52B + 11.014C +47.62667D-1.875AB-0.34AC-0.85AD+0.31BC+0.425BD+0.02CD-3.51917A2-5.93167B2-0.20827 C2-2.96917D2。

由表 4 可以看出：B，C，A2，B2，C2，D2對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶感官品質(zhì)的影響極顯著，A 和、AB 對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶感官品質(zhì)有顯著影響，影響酸棗仁苦蕎酸奶感官品質(zhì)的因素先后順序?yàn)榻泳浚舅釛椚士嗍w漿添加量＞白砂糖添加量＞發(fā)酵時(shí)間?？傮w分析，回歸模型P＜0.001，表明該模型極顯著；同時(shí)，回歸模型的失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），R2Adj= 95.21 %，說(shuō)明95.21%的數(shù)據(jù)都可以用這個(gè)二次方程解釋。

2.5.2 兩因素交互作用影響發(fā)酵工藝的響應(yīng)面分析

做出響應(yīng)曲面，分析白砂糖添加量（A），接菌量（B），酸棗仁苦蕎漿添加量（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶感官品質(zhì)的影響，結(jié)果如圖5 所示。

響應(yīng)面圖可以評(píng)價(jià)白砂糖添加量、接菌量、酸棗仁苦蕎漿添加量和發(fā)酵時(shí)間之間的交互作用及對(duì)酸棗仁苦蕎酸奶感官品質(zhì)的影響，由響應(yīng)面圖可知曲面有極大值，工藝的最優(yōu)配方在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，等高線圖近似于橢圓形，說(shuō)明各因不交互作用較為顯著，這與表4顯著性分析結(jié)果一致。

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以酸棗仁苦蕎酸奶的感官品質(zhì)評(píng)分為最終優(yōu)化值，經(jīng)Design-Expert8.0 軟件預(yù)測(cè)可得最佳發(fā)酵工藝為：白砂糖添加量8%，接菌量5%，酸棗仁苦蕎漿添加量20%，42 ℃下發(fā)酵7 h 后4 ℃下冷藏后熟，產(chǎn)品感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為92.4 分。為了檢驗(yàn)回歸模型預(yù)測(cè)的可靠性，在預(yù)測(cè)條件下重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)，得到產(chǎn)品的平均感官評(píng)分為92.8 分，測(cè)定值與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為0.4%，與預(yù)測(cè)值基本一致。此時(shí)產(chǎn)品呈淡藕荷色，質(zhì)地均勻，口感細(xì)膩，無(wú)乳清析出，有酸乳的香氣、酸棗仁的芳香及苦蕎的麥香。

表3 優(yōu)化發(fā)酵工藝Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖5 白砂糖添加量、接菌量及交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線

表4 發(fā)酵工藝優(yōu)化方差分析

圖6 白砂糖添加量、酸棗仁苦蕎漿添加量及交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線

對(duì)產(chǎn)品理化性質(zhì)及黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，參考國(guó)標(biāo)GB19302-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果如表5所示。由表5可以得出，酸棗仁苦蕎酸奶各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)，且產(chǎn)品中由于添加了藥食同源的酸棗仁、蕎麥漿而含有黃酮（6.89±0.02）mg/100g，總抗氧化能力（1.019±0.002）mmol/g。

圖7 白砂糖添加量、發(fā)酵時(shí)間及交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線

圖8 接菌量、酸棗仁苦蕎漿添加量及交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線

3 結(jié) 論

圖9 接菌量、發(fā)酵時(shí)間及交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線

圖10 酸棗仁苦蕎漿添加量、發(fā)酵時(shí)間及交互作用對(duì)感官評(píng)分的響應(yīng)面和等高線

表5 理化指標(biāo)及黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

本文通過(guò)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法分別分析酸棗仁苦蕎酸奶發(fā)酵工藝條件與產(chǎn)品感官品質(zhì)之間的關(guān)系，確定酸棗仁苦蕎酸奶的最佳發(fā)酵工藝為：白砂糖添加量8%，接菌量5%，酸棗仁苦蕎漿添加量20%，42 ℃下發(fā)酵7 h 后4 ℃下冷藏后熟得到的產(chǎn)品呈淡藕荷色，質(zhì)地均勻，口感細(xì)膩，乳清析出少，有酸乳的香氣及酸棗仁的芳香。經(jīng)測(cè)定，酸乳各項(xiàng)理化指標(biāo)符合GB19302-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》的各項(xiàng)指標(biāo)，且黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（6.89±0.02）mg/100g，抗氧化能力（1.019 ± 0.002）mmol/g，說(shuō)明酸棗仁及苦蕎中的黃酮部分保留在了發(fā)酵酸乳中。這為藥食兩用作物酸棗仁及苦蕎在保健食品中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供借鑒。