牛乳中嗜冷菌及其耐熱酶研究進展

張樹飛，薛玉玲，崔玥，韓俊華，朱宏，王世杰，

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊 050018；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221）

0 引 言

在20 ℃以下能生長繁殖，最適生長溫度為10～15 ℃的微生物定義為嗜冷菌[1]。嗜冷菌是引起牛乳質(zhì)量問題的主要微生物之一。通常，在擠奶、儲存和運輸過程中容易發(fā)生嗜冷菌污染[2]，從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量問題。在低溫存儲過程中，嗜冷菌仍然能夠生長繁殖[3]，并且能夠產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶等多種水解酶類[4]，釋放到牛乳中。當采用加熱殺菌時，嗜冷菌菌體較容易殺滅[5]，而其產(chǎn)生的酶類具有熱穩(wěn)定性[6]，仍然能夠保持一定的活性。脂肪酶和蛋白酶是影響牛乳品質(zhì)的主要腐敗酶[7]，這些酶在牛乳中長時間作用，會破壞其中的營養(yǎng)物質(zhì)，影響牛乳的品質(zhì)。

1 牛乳中的嗜冷菌

1.1 種類

牛乳中嗜冷菌的主要菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、沙雷氏菌屬(Serratia)、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）等[8]。有研究報道，來自某農(nóng)場和奶罐的20 個不同的原奶樣品中共鑒定出2 906 株嗜冷菌，其屬于169 個種和61 個屬。其中，假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳球菌屬（Lactococcus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）是最豐富的屬，占所有菌株的62%。在所有分離株中，有18%屬于迄今未知的物種，這表明部分牛乳微生物區(qū)系尚未開發(fā)[9]。

1.2 產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶

牛乳中的嗜冷菌具有產(chǎn)生腐敗酶的能力，主要有蛋白酶和脂肪酶[10]。其產(chǎn)生的蛋白酶殘留在牛乳中，緩慢作用于牛乳蛋白，分解α-酪蛋白和κ-酪蛋白[11]，釋放出帶苦味的氨基酸和短肽，導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)苦味、澀味等非正常風味[12]；也會導(dǎo)致酪蛋白膠束的ζ電勢降低[13]，使UHT 乳在貯存過程中出現(xiàn)蛋白質(zhì)凝膠和乳清析出現(xiàn)象[11]。嗜冷菌也是牛乳中微生物脂肪酶的主要來源，其產(chǎn)生的脂肪酶主要是胞外酶[14]。脂肪酶能水解脂肪為甘油和游離脂肪酸[15]，導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)脂肪氧化味、腐臭等異味[16]，同時會導(dǎo)致脂肪上浮速度加快，進而影響牛乳的品質(zhì)。

不同的嗜冷菌產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶的能力有所差異。假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)和金黃桿菌屬(Chyseobacterium)的一些菌種產(chǎn)生蛋白酶的能力較強，而一些不動桿菌屬（Acinetobacter）的菌種具有較強的脂肪酶產(chǎn)生能力[17]。牛乳中產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶的主要嗜冷菌菌屬和菌種見表1。

表1 產(chǎn)生蛋白酶和脂肪酶的主要菌屬和菌種

2 嗜冷菌產(chǎn)生的酶的熱穩(wěn)定性

2.1 蛋白酶

嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶具有熱穩(wěn)定性，很難通過巴氏殺菌、高溫瞬時滅菌等常規(guī)熱處理技術(shù)使其失活[23-24]。研究表明，熒光假單胞菌07A(Pseudomonas fluorescens 07A)分泌的胞外蛋白酶具有477 個氨基酸以及高度保守的Ca2+和Zn2+結(jié)合域，屬于金屬蛋白酶，在72 °C 下處理15 s 后保留31.7%±0.37%的活性，而經(jīng)過65 °C、30 min 處理后保留14.3%±0.37%的活性，即使分別在 80 °C、90 °C 和100 °C 下處理 5 min，該蛋白酶仍保留其初始活性的44.1%±1.10%、43.6%±0.58%和40.5%±1.73%[25]。在 UHT 脫脂牛乳、半脫脂牛乳、全脂牛乳3 種產(chǎn)品中，液化沙雷氏菌L53(Serratia liquefaciens L53)分泌的蛋白酶 Ser2 在 140 °C 下處理 4 s 的殘留活性在 90%～95%之間，65 °C 處理 30 min 后的殘留活性在87%～95%之間，在72 °C 熱處理20 s 后，未觀察到對蛋白酶活性的影響[11]。近幾年研究報道的牛乳中嗜冷菌分泌的蛋白酶的熱穩(wěn)定性見表2。

表2 乳源嗜冷菌分泌的蛋白酶的熱穩(wěn)定性

2.2 脂肪酶

脂肪酶具有較強的耐熱性，在經(jīng)過較高溫度處理后依然能夠保持一定的活性[28]。石璞潔等[29]報道了不同的溫度時間處理對熒光假單胞菌脂肪酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)50 ℃、30 min，63 ℃、30 min，72 ℃、20 s處理后，殘留的脂肪酶相對酶活力分別為75.02%、86.21%、73.25%；90 ℃ 、10 min，121 ℃ 、0.1 MPa、20 min 處理后，殘留的脂肪酶相對酶活力分別為17.62%和13.63%。近幾年報道的牛乳中嗜冷菌分泌的脂肪酶的熱穩(wěn)定性見表3。

3 嗜冷菌及其酶的控制措施

避免由嗜冷菌及其酶引起的牛乳質(zhì)量問題，主要還是通過對嗜冷菌進行控制。當前策略主要包括保持奶站和牧場良好的衛(wèi)生環(huán)境[34-37]、使用生物防腐劑抑制嗜冷菌的生長[38]、CO2和 N2處理[39-43]、高壓均質(zhì)和微濾處理[44-46]。

3.1 保持奶站和牧場良好的衛(wèi)生環(huán)境

嗜冷菌通常散布在衛(wèi)生環(huán)境較差的奶牛場中。牛乳中嗜冷菌的數(shù)量和類型受設(shè)備清潔度、飼料、動物健康狀況以及周邊環(huán)境等因素的影響[34]。奶站及牧場應(yīng)為奶牛提供整潔的場所，并對奶牛的生產(chǎn)環(huán)境進行嚴格的控制，對于擠奶設(shè)備需要及時的消毒，最大限度的減小嗜冷菌感染的風險[35-36]。褚立群[36]提出了通過及時清理牛床上的糞便、增添干凈墊料、每天刷洗牛體、保持牛身清潔等方法來控制奶牛的生產(chǎn)環(huán)境，以降低嗜冷菌的感染風險。Bradley[37]等人報道了擠奶前對乳頭進行消毒并干燥處理，可減少牛乳中的鏈球菌、腸球菌的數(shù)量；當不同奶牛進行擠奶時，需要進行集體消毒，這與牛乳中嗜冷菌數(shù)量的減少有關(guān)。

表3 乳源嗜冷菌分泌的脂肪酶的熱穩(wěn)定性

3.2 添加生物防腐劑

目前對于生物防腐劑的研究主要是噬菌體對于嗜冷菌的抑制作用。噬菌體能夠感染嗜冷菌細胞，裂解嗜冷菌細胞以釋放它們的后代，然后重復(fù)感染和裂解這個循環(huán)，直到嗜冷菌種群嚴重減少[5]，隨著嗜冷菌數(shù)量的降低，其分泌到牛乳中的耐熱性蛋白酶和脂肪酶也隨之減少，對于牛乳的危害減小。Hu 等[38]人在2016 年的研究中報道了，在含有嗜冷假單胞菌的UHT 牛乳中添加噬菌體混合物可使假單胞菌的細胞數(shù)顯著降低2 log CFU/mL；當在原料乳中添加噬菌體混合物時，無論是在4 ℃下還是在25 ℃下儲存，嗜冷菌的數(shù)量均減少了1 log CFU/mL；原料乳在4 ℃下冷藏5 d 后，經(jīng)過噬菌體處理的原料乳比未經(jīng)噬菌體處理的樣品中的嗜冷菌數(shù)量低了4 log CFU/mL。該研究表明了噬菌體對于牛乳中嗜冷菌的顯著抑制作用。Tanaka 等[5]報道了用噬菌體HU1 處理的脫脂牛乳和全脂牛乳比未處理樣品中的假單胞菌活細胞數(shù)降低了 1 000 倍，同時，在 63 ℃ 加熱 30 min 后，噬菌體的活性降低到不可檢測的水平，顯著提高了產(chǎn)品的安全性。因此，使用噬菌體處理牛乳可能是減少牛乳中嗜冷菌數(shù)量、降低耐熱酶對于牛乳的危害的有效方法。

3.3 CO2和 N2處理

CO2已經(jīng)成為一種有潛力的原料乳的防腐劑，它可以抑制嗜冷菌的生長，降低嗜冷菌合成耐熱性蛋白酶和脂肪酶的速率，且其方法為非熱處理，對牛乳的營養(yǎng)成分不會產(chǎn)生不利影響，因此被公認為是安全的[39]。向牛乳中充入適量的CO2，CO2與嗜冷菌細胞質(zhì)中的水發(fā)生水合反應(yīng)會生成碳酸使pH 降低，且CO2會取代O2，會影響嗜冷菌正常的代謝[40]。研究表明，經(jīng)過CO2處理的原料乳出現(xiàn)變質(zhì)的時間至少可以推遲7 d[39]，且使用經(jīng)CO2處理的原料乳生產(chǎn)的UHT牛乳在儲存120 d 期間呈現(xiàn)較低的蛋白水解和脂解作用[41]。因此，用CO2處理原料乳將有利于改善UHT 乳的質(zhì)量，降低牛乳中蛋白酶的蛋白水解和脂肪酶的脂解作用。

也有研究表明，用純凈的N2連續(xù)沖洗原料乳能夠顯著抑制嗜冷菌的生長，減少蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生，降低冷藏期間蛋白水解和脂解作用，延長原料乳的冷藏時間[42-43]。

3.4 高壓均質(zhì)和微濾處理

高壓均質(zhì)是乳制品加工中常用的處理技術(shù)。有研究表明，高壓均質(zhì)在控制蛋白酶引起的蛋白質(zhì)水解方面效果顯著。Oliveira 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪含量3%的牛乳經(jīng)100 MPa 和150 MPa 壓力處理后，蛋白水解分別顯著降低了29%和51%，產(chǎn)品出現(xiàn)凝膠的時間分別延遲了23 d 和40 d。在UHT 處理前和處理后，分別經(jīng)250 MPa 和400 MPa 雙均質(zhì)化處理，也成功地防止了UHT 牛乳由于脂肪酶造成的脂肪分解，顯著改善了其貯存期[45]。

微濾可延長原料乳的保質(zhì)期和改善UHT 牛乳質(zhì)量。在高體細胞數(shù)和低體細胞數(shù)的原料乳中，微濾處理使牛乳菌落總數(shù)顯著降低了3.56 和3.57 log CFU/mL，且分別加工成UHT 乳后，其貨架期有效延長了63 d 和21 d[46]。微濾還可以延遲UHT 牛乳中凝膠和沉淀物的形成，并減少蛋白水解[45]。

4 結(jié) 語

牛乳中嗜冷菌的種類繁多，目前已有部分確定了其菌屬，還有一部分尚未發(fā)掘，且對于嗜冷菌的嗜冷機制鮮有報道；另外，嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶具有熱穩(wěn)定性，會對牛乳造成破壞，然而對于其產(chǎn)生的酶類的耐熱機制和酶的具體種類很少有研究，還需要進一步的探索。對于嗜冷菌及其酶的控制，最主要的還是從源頭對嗜冷菌進行控制，以減少耐熱酶的產(chǎn)生。因此，發(fā)掘天然、無毒害的抑菌物質(zhì)也是當今的重要任務(wù)，還需要進一步的探索研究。