淫羊藿苷對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠TNF-α、IL-6、IL-8、NF-kB和磷酸化NF-kB水平的影響

王 平，曹保利，李棣華，楊 磊，劉 帥，曹 穎，劉俊紅，呂沅珊

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300100；2.天津南開醫(yī)院婦產(chǎn)科）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是生育期婦女常見疾病，是一種良性的婦科疾病，以具有活性的子宮內(nèi)膜異位在子宮以外的其它地方為特征，是一種炎癥性、雌激素依賴性疾病，常引起痛經(jīng)、盆腔炎癥和不孕等并發(fā)癥。臨床上約有10%～15%的生育期婦女患有此疾病，而不孕的婦女中有20%-40%的女性患有EMs，是一種需要終身治療的慢性疾病[1～3]。雖然EMs是一種良性的婦科疾病，但以惡性腫瘤的方式存在，對女性的健康產(chǎn)生重大的威脅[4]。目前，臨床上治療EMs的藥物并不是很理想，對EMs的治療還處在探索階段。淫羊藿苷（icariin，ICA）是中草藥淫羊藿的提取物，其具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[5]，相關(guān)研究表明，淫羊藿有雌激素樣作用，可以提高去卵巢大鼠的骨密度與骨重量[6]。本文目的是探討淫羊藿苷對EMs大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8和NF-kB和p-NF-kBp65水平的影響，為EMs的治療提供新的理論依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 淫羊藿苷，規(guī)格：20mg，中國生物制品檢定所，批號110737-201415；硫酸慶大霉素注射液，華中藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H42021503；10%水合氯醛（0.3mL/100g體重），天津市南開醫(yī)院分子生物研究實驗室提供；10%福爾馬林溶液，天津市南開醫(yī)院病理實驗室；無菌PBS緩沖液，購自中奧天元生物有限公司；大鼠白細胞介素-6（IL-6）、大鼠白細胞介素-8（IL-8）、大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的酶鏈免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒，均購自上?？道噬锟萍加邢薰?；小鼠抗人磷酸化核因子kB（Ser536）單克隆抗體，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 全自動脫水機（ASP300S，德國Leica公司）、病理石蠟包埋機（德國Leica公司）、切片機（德國Leica公司）、攤片機（德國Leica公司）、烤片機（德國Leica公司）、電熱恒溫水浴箱（型號DKB-600D，上海橫一科學儀器有限公司生產(chǎn)）、電熱鼓風干燥箱（型號DHG-101 3型，上海昕儀儀器儀表有限公司）、研究型正置熒光顯微鏡（型號DM4000B，德國Leica公司，攝像頭為DFC500，圖像采集軟件為LAS V3.7）。多功能酶標儀（型號varioskanflash3001，thermo fisher scientific公司）

1.1.3 實驗動物 清潔級健康未交配過的SD雌性大鼠30只（中國食品藥品檢定研究所，國家實驗動物質(zhì)量檢測中心，SCXK（京）2014-0013），體重180～220g，常規(guī)飼養(yǎng)，室溫，自然光照。分籠飼養(yǎng)，每籠6只。適應性喂養(yǎng)7天。本實驗經(jīng)天津中醫(yī)藥大學動物實驗中心動物倫理委員會審批許可，審批號為TCM-LAEC2018026。

1.2 方法

1.2.1 大鼠EMs模型的建立及成模情況參考非動情期大鼠EMs模型的建立方法[7，8]，30只雌性SD大鼠，經(jīng)腹腔注射10%的水合氯醛（0.3mL/100g）進行麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠移至鼠板，固定其頭與四肢，暴露腹部，備皮，手術(shù)用阿爾碘消毒，鋪無菌孔巾，開腹，找到“Y”字形子宮，將大鼠右側(cè)子宮分離暴露，近卵巢約1cm處與右側(cè)子宮宮頸處兩端結(jié)扎，將子宮剪斷，長約2cm，迅速將剪下的組織放置于盛有0.9%生理鹽水的無菌培養(yǎng)皿中；在無菌培養(yǎng)皿中將多余的脂肪和結(jié)締組織剔除，沿系膜部位將組織縱行剪開，將組織剪成大小約4mm*4mm的內(nèi)膜組織片段2段；將子宮內(nèi)表面上皮與腹壁相貼合，左右兩側(cè)腹壁血管豐富處各縫一塊，用7-0帶針無損傷線將剪下來組織的四個角縫合在腹壁血管豐厚處上；用生理鹽水將腹腔沖洗干凈，然后在大鼠腹腔內(nèi)滴入用生理鹽水稀釋過的鹽酸慶大霉素注射液2～3mL預防感染，用4-0絲線關(guān)腹縫合，用苦味酸涂抹傷口，以防大鼠撕咬傷口；術(shù)后2只大鼠因腹腔感染死亡，其余28只均成模。

1.2.2 分組及給藥方法 隨機將大鼠分為4組：空白對照組，模型組，ICA高劑量組，ICA低劑量組，每組7只?？瞻讓φ战M、模型組：15mL·kg-1d-1，ICA高劑量組：100mg·kg-1d-1，ICA低劑量組：50mg·kg-1d-1，連續(xù)給藥28天。

1.2.3 EMs標本采集及處理連續(xù)灌胃給藥28天后，在末次給藥24h內(nèi)，用10%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)目內(nèi)眥靜脈采血1mL，開腹，剪取腹壁移植物，及空白組剪取子宮，每個組織在無菌PBS中沖洗樣本3次，盡量去除血液。用吸水紙將組織上液體盡量吸干。將該組織，分別切割3份，其中一份組織放入多聚甲醛/福爾馬林中離心管中，封口膜封口，待HE檢測，另外兩份放置-80℃冰箱過夜，轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存待其他檢測。

1.2.4 EMs組織HE染色 將固定在福爾馬林中的組織進行脫水，經(jīng)石蠟包埋好，準備切片，將切片好的組織進行常規(guī)操作染色，最后用中性樹膠封片于光鏡下觀察組織變化。

1.2.5 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量 將采取的靜脈血置于離心機，1000r，20min，離心，分離血清，-20℃保存，待檢用。采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平，操作嚴格按照試劑盒所標示的步驟進行。酶標儀在450nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，在加終止液15min內(nèi)進行檢測，根據(jù)標準曲線，將大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-8含量進行計算，得出數(shù)值。

1.2.6 以免疫印跡法檢測異位內(nèi)膜組織中的NFkB和磷酸化NF-kB水平 將存于液氮罐中的內(nèi)膜異位組織取出，將組織樣品稱取適量，放置于液氮預冷的研缽中，在研缽中加液氮將樣品充分研磨至粉末。加入粉末4倍體積裂解緩沖液（8 M尿素，1%蛋白酶抑制劑和2 mM EDTA），超聲裂解。4℃，12000 g離心10 min，去除細胞碎片，將上清液置入新的離心管中，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸變性5～10min，制備SDSPAGE凝膠，電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，依次孵育一抗、二抗，ECL化學發(fā)光法顯影。Image-ProPlus6.0軟件對其進行分析處理。

1.3 統(tǒng)計學處理方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，x±s表示計量資料，多個樣本之間采用方差分析（P<0.05，P<0.01），表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)異癥組織病理學觀察

空白組光鏡下可見黏膜上皮完整，細胞呈柱狀，細胞分布均勻，腺體數(shù)量多且完整。模型組光鏡下可見宮內(nèi)膜腺體，子宮內(nèi)膜間質(zhì)及含鐵血黃素；移植物腺體增生，腺上皮呈高柱狀排列。淫羊藿苷高劑量組與淫羊藿苷低劑量組在光鏡下均可見移植組織內(nèi)膜粘膜上皮變薄，呈萎縮性改變，呈縫隙狀改變，移植組織內(nèi)膜腺體可見明顯減少，腺腔較模型組明顯變窄，腺上皮萎縮明顯，呈扁平狀或矮立方狀，間質(zhì)中有少量白細胞浸潤，部分異位組織腺上皮明顯被破壞甚至消失（見圖1～4）。

2.2 ICA對大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-8含量的影響

以模型組作為參照，空白組與之相比較，TNFα、IL-6、IL-8含量的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。ICA低劑量組與高劑量組與之相比較，TNF-α、IL-6、IL-8含量差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）（見表1）。

2.3 ICA對大鼠EMs組織中NF-kB和磷酸化NF-kB蛋白水平的影響

模型組作為參照，空白組與之相比較，磷酸化NF-kB表達差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。ICA低劑量組與ICA高劑量組與之相比較，磷酸化NF-kB表達差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）（見表2，圖5）。

表1 ICA對大鼠血清中白細胞介素-6（IL-6’ng×L-1）白細胞介素-8（IL-8’ng×L-1）和腫瘤壞死因子（TNF-a’ng×L-1）水平的影響（x±s，n）

表2 ICA對大鼠EMs模型異位內(nèi)膜組織中核因子kB（NF-kB）蛋白和磷酸化核因子kB（p-NF-kB）表達水平的影響

3 討論

EMs是婦科常見的疾病，是一種炎癥性、雌激素依賴性疾病，也是臨床上引發(fā)不孕的危險因素之一[9，10]。TNF-α、IL-6、IL-8都是重要的炎癥因子，對EMs的診斷具有一定的臨床意義[11]。相關(guān)研究表明IL-6可以作為炎癥早期的因子，促進其他炎癥因子的分泌，使炎癥反應放大[12]。IL-8是通過巨噬細胞和其他細胞分泌，可使中性粒細胞趨化，促使新的血管形成，在炎癥的反應中起著至關(guān)重要的作用[13]。TNF-α在機體處于正常水平下其水平表現(xiàn)較低，當機體處于炎癥反應時其水平明顯升高，這是由于單核巨噬細胞分泌的具有防御和治病雙重作用的細胞因子所導致[14]。NF-kB在調(diào)解細胞反應中有著重要的作用，在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起著關(guān)鍵的作用。NF-kB可以通過調(diào)節(jié)與炎癥細胞浸入有關(guān)的因子基因表達，在炎癥反應與免疫反應中發(fā)揮重要作用[15]。ICA是淫羊藿的提取物，淫羊藿中被分離鑒定的單體化合物有260余種，但其中以ICA的含量最高。王坤雅通過研究證實，淫羊藿苷可以下調(diào)EMs細胞分泌MMP-2、MMP-9蛋白，從而抑制EMs細胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)ICA通過抑制NF-kB p65蛋白的磷酸化和阻斷IkB-a蛋白降解，提高GR-mRNA和蛋白的表達水平，調(diào)節(jié)GR受體，抑制NF-kB活化及下游炎性因子產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。ICA通過抑制由NF-κB和PPARα和PPARγ介導的炎癥反應對大鼠缺血性中風具有神經(jīng)保護作用。

本研究結(jié)果顯示，ICA可以顯著降低大鼠EMs組織中的TNF-α、IL-6、IL-8的含量。并且，ICA高劑量組和ICA低劑量組都可以對異位內(nèi)膜起到抑制作用。高劑量組強于低劑量組。說明ICA通過抑制EMs異位組織促炎癥因子的釋放，改善EMs。其改善可能由于ICA通過對NF-kB信號通路的抑制而發(fā)揮的作用。從實驗結(jié)果可知ICA可以顯著降低EMs大鼠異位組織中的NF-kB蛋白的磷酸化水平。從某種程度上也說明ICA可以抑制內(nèi)膜異位組織中的NF-kB蛋白的激活，抑制下游炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，抑制促炎因子的釋放，起到緩解EMs的作用。