普濟煎液對豚鼠EB病毒的抑制及免疫干預(yù)作用

江偉熾，蘇旭春，閆冰川，孔嘉欣，程 玲，宋 璟

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)綜合二科）

EB病毒感染可誘發(fā)鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌等多種腫瘤[1]。尤其在未分化型的鼻咽癌中，95%以上的患者感染EB病毒[2]。而且，EBV-DNA水平還與鼻咽癌治療和預(yù)后密切相關(guān)[3]。因此治療EB病毒感染，對鼻咽癌治療具有重要意義。中藥抗EB病毒感染具有獨特優(yōu)勢，能有效抑制EBV-DNA復(fù)制，促進鼻咽癌康復(fù)[4]。本課題組曾采用普濟煎液進行臨床觀察，證明普濟煎液對鼻咽癌患者EB病毒有抑制作用[5]。為進一步探討探究普濟煎液抑制EB病毒增殖的作用機制，本研究建立豚鼠感染EBV模型，檢測用藥后豚鼠外周血單 個 核 細 胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMSc）中EBV-DNA拷貝數(shù)以及血清免疫因子含量變化。

1 材料

1.1 實驗細胞

狨猴EBV轉(zhuǎn)化的白細胞B95-8，由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.2 實驗動物

普通級FMMU雄性豚鼠，60只，體重240～280 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，生產(chǎn)許可編號：SCXK（粵）2016-0041。

1.3 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清購自GIBCO公司；細胞DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；病毒DNA基因組提取試劑盒購自北京索萊寶公司；豚鼠外周血單個核細胞分離液購自天津灝洋（TBD）；EB病毒染料法熒光定量PCR試劑盒購自北京天恩澤有限公司；EB病毒早期抗原（EBV-VCA）抗體IgG ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；豚鼠IL-10、IL-8 ELISA試劑盒購自江萊生物有限公司；豚鼠IL-6、TNF-αELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司；豚鼠IFN-γELISA試劑盒購自酶免有限公司。

1.4 主要藥物

阿昔洛韋購自麥克林有限公司，產(chǎn)品批號A829547 25 g。普濟煎液組方：牛蒡子15 g，女貞子15 g，夏枯草15 g，黃芩10 g，連翹10 g，柴胡10 g，陳皮5 g，射干10 g，僵蠶10 g，板藍根30 g，貓爪草30 g，太子參10 g，玄參20 g，生地黃15 g，甘草5 g。實驗用中藥由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)自動煎藥機煎煮。

1.5 主要實驗儀器

Svnergyr2多功能酶標儀，美國BioTek公司；CFX96 Real-Time Systerm，美國BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

B95-8細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃，4%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周。當細胞計數(shù)達約5×106個/mL時，靜置于33℃，4%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，于-80℃及37℃反復(fù)凍融3次，8 000×g離心30 min，取上清用0.45 μm濾器過濾，收集溶液于-80℃保存?zhèn)溆肹6]。

2.2 EB病毒液病毒載量測定

取收集的EB病毒液，根據(jù)病毒DNA提取試劑盒說明書操作提取病毒DNA。使用EB病毒染料法熒光定量PCR試劑盒測定EB病毒載量，檢測樣品設(shè)置3個復(fù)孔取平均值，根據(jù)qPCR所得Ct值計算病毒載量。

2.3 動物模型建立及給藥方法

將普通級豚鼠60只分成2組，分別為正常對照組10只，病毒組50只。所有豚鼠置于實驗環(huán)境溫度為20℃～22℃，12 h晝夜交替光照[7]，在動物房適應(yīng)1周后，正常對照組經(jīng)滴鼻、口腔接種100μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基，病毒組接種100μL病毒液，計量為2.0×106病毒載量/只。接種1周后，局部麻醉，經(jīng)股動脈取血5mL，分離外周血單個核細胞，檢測EBV-DNA復(fù)制載量。正常對照組在取血過程中死亡1只，共有36只豚鼠造模成功。把動物分為模型組、阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組各9只。阿昔洛韋組予阿昔洛韋組灌胃，普濟煎液組予普濟煎液灌胃，模型組和正常對照組分別予等比例生理鹽水灌胃，給藥1次/天，持續(xù)2周。阿昔洛韋組用藥量為0.04 g/kg，低劑量普濟煎液組為17.5 g/kg，高劑量組35 g/kg。末次給藥后禁食12 h，使用10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉后，剖胸心臟取血，一份使用檸檬酸鈉抗凝管取血5 mL檢測外周血單個核細胞中EB病毒復(fù)制載量，另一份使用離心管取血10 mL檢測血清中免疫因子含量。

2.4 外周血單個核細胞EB病毒載量測定

取使用檸檬酸鈉抗凝采血管采血樣與等量分離液混合后，按照豚鼠外周血單個核細胞分離液說明書加入分離液中，500 g，離心30 min。離心后溶液分為四層，第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層，第三層為分離液層，第四層為紅細胞層。用干凈的15 mL離心管收集第二層細胞，加入10 mL清洗液，250 g，離心10 min。收集沉淀，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，按照細胞DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并測定DNA濃度。根據(jù)北京天恩澤公司EB病毒染料法熒光定量PCR試劑盒說明書操作，測定外周血單個核細胞中EBV病毒載量。每個樣本取3個復(fù)孔，反應(yīng)條件為：預(yù)變性，95℃，2 min；PCR反應(yīng)，溫度91℃，15 s，58℃，60s，共45個循環(huán)。以6個陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線，再以待測陽品Ct值從標曲上找出其濃度的log值，計算出待測樣品的DNA濃度。

2.5 ELISA指標檢測

取無抗凝血樣，室溫放置2 h后，250 g離心5 min，小心收集上清于干凈離心管中，根據(jù)豚鼠IL-10、IL-6、IL8、TNF-α、IFN-γ試劑盒以及EBV-VCA IgG試劑盒說明書進行檢測，于450nm吸光度測定OD值，計算濃度值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16.0進行分析，所有數(shù)據(jù)相互獨立，以x±s表示，采用單因素方差分析法進行多樣本比較，組間比較采用LSD檢驗，結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 繪制EB病毒液拷貝數(shù)的標準曲線

根據(jù)qPCR擴增結(jié)果，繪制標準曲線（見圖1），檢測EBV-DNA拷貝數(shù)標曲方程為y=-2.6909x+27.722，R2=0.999。根據(jù)病毒液qPCR的Ct值為9.554，計算出病毒DNA載量約為2.01×107copies/mL病毒載量。

3.2 豚鼠接種EB病毒1周后外周血單個核細胞中EB病毒拷貝數(shù)

把正常對照組編號為1～10，病毒組分為5組，分別編號A1-10、B1-10、C1-10、D1-10、E1-10，共有36只豚鼠檢測到EBV-DNA復(fù)制，正常對照組在取血過程中死亡1只（見表1）。

表1 各組豚鼠接種EB病毒1周后外周血單個核細胞中EBV-DNA拷貝數(shù)

3.3 各組豚鼠體重變化比較

實驗過程中，模型組豚鼠死亡2只。灌胃前1天、第7天，正常對照組，模型組、阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組體重變化比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。灌胃第14天，與模型組比較，正常對照組、阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組豚鼠體重顯著升高（P<0.05），高劑量普濟煎液組體重較阿昔洛韋組升高（P<0.05）（見表2）。

表2 各組豚鼠灌胃前1天、灌胃第7天、灌胃第14天體重比較(g，）

表2 各組豚鼠灌胃前1天、灌胃第7天、灌胃第14天體重比較(g，）

注：與正常對照組比較，＊P>0.05；與模型組相比，＃P<0.05

組別正常對照組模型組阿昔洛韋組低劑量組高劑量組n/只灌胃第14天296.78±19.35＃271.57±11.39 297.25±20.38＃294.11±7.85＃317.78±20.28＃9 7 9 9 9灌胃前1天263.78±8.07 266.57±9.19＊265.12±9.18＊263.56±5.94＊261.44±8.27＊灌胃第7天269.67±9.06 273.14±5.15＊274.25±5.95＊270.78±8.38＊271.89±6.25＊

3.4 重新繪制EB病毒拷貝數(shù)的標準曲線

檢測EB病毒DNA拷貝數(shù)標曲方程為y=-2.821x+27.544，R2=0.9978。利用新的標準曲線方程，根據(jù)樣本的Ct值，計算灌胃2周后豚鼠外周血單個核細胞中EBV-DNA拷貝數(shù)變化（見圖2）。

3.5 灌胃2周后各組豚鼠外周血單個核細胞中EBV-DNA拷貝數(shù)比較

與模型組比較，阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組中EBV-DNA拷貝數(shù)降低（P<0.05）；與阿昔洛韋組比較，高劑量普濟煎液組中EBV-DNA拷貝數(shù)降低（P<0.05）（見表3）。

表3 各組豚鼠EBV-DNA復(fù)制載量比較(1×104copies/μgDNA，)

表3 各組豚鼠EBV-DNA復(fù)制載量比較(1×104copies/μgDNA，)

注：與正常組比較，＊P<0.05，＃與模型組比較，＃P<0.05

EBV-DNA復(fù)制載量0.00±0.00 0.37±0.86＊0.25±0.16＊＃0.24±0.15＊＃0.22±0.11＊＃組別正常對照組模型組阿昔洛韋組低劑量組高劑量組n/只9 7 9 9 9

3.6 灌胃2周后各組豚鼠血清中EBV-VCA IgG、IL-10、IFN-γ含量比較

與正常對照組比較，模型組、阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組中EBV-VCA IgG顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，阿昔洛韋組、低、高劑量組普濟煎液組中IL-10含量降低（P<0.05），阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組中IFN-γ含量顯著升高（P<0.05）；與阿昔洛韋組比較，低、高劑量普濟煎液組中IFN-γ含量升高（P<0.05）（見表4）。

表4 各組豚鼠血清中EBV-VCA IgG、IL-10、IFN-γ含量比較(pg/mL，)

表4 各組豚鼠血清中EBV-VCA IgG、IL-10、IFN-γ含量比較(pg/mL，)

注：與正常組比較，＊P<0.05；與模型組比較，＃P<0.05

組別正常對照組模型組阿昔洛韋組低劑量組高劑量組n/只IL-10 29.44±0.21 29.53±0.32 29.07±0.30＃29.07±0.33＃28.98±0.27＃9 7 9 9 9 EBV-VCA IgG 0.09±0.03 1.69±0.86＊1.63±0.13＊1.59±0.12＊1.64±0.97＊IFN-γ 55.45±1.33 52.37±3.16 57.73±1.38＃62.46±1.80＃63.59±1.25＃

3.7 灌胃2周后各組豚鼠血清中IL-6、IL-8、TNFα含量比較

與模型組比較，阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組中IL-6、TNF-α含量顯著升高（P<0.05）；阿昔洛韋組血清中IL-6含量與低、高劑量普濟煎液組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；正常對照組、阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組血清中IL-8含量比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；高劑量普濟煎液組中TNF-α含量較阿昔洛韋組顯著升高（P<0.05）（見表5）。

表5 各組豚鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量比較(pg/mL，)

表5 各組豚鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α含量比較(pg/mL，)

注：與模型組比較，＊P<0.05；與阿昔洛韋組比較，＃P<0.05

組別正常對照組模型組阿昔洛韋組低劑量組高劑量組n/只9 7 9 9 9 IL-6 22.06±0.43 22.28±0.80 26.98±0.89＊27.06±1.07＊27.26±0.82＊IL-8 27.87±0.41 27.97±0.40 27.96±0.37 27.66±0.51 27.56±0.59 TNF-α 35.27±1.23 34.06±0.85 37.11±1.17＊37.90±0.65＊41.22±1.15＊＃

4 討論

EB病毒在人群中具有普遍易感性，據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)共有90%以上的人感染EB病毒[8]。EB病毒感染多發(fā)生在幼兒時期，感染后多表現(xiàn)為隱性感染或者潛伏狀態(tài)，一般無明顯或伴隨較弱的臨床癥狀[9]。EB病毒作為一種致癌病毒，與鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌等多種惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)，其中與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[10]。研究表明，在鼻咽癌患者治療中，治療后血清中EBVDNA水平持續(xù)增高，可增加鼻咽癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風險[11]。因此，治療EB病毒感染與鼻咽癌預(yù)后密切相關(guān)。

EB病毒主要感染B淋巴細胞及上皮細胞，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生固有免疫及特異性免疫應(yīng)答，其中Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）介導(dǎo)的信號通路是固有免疫的重要信號通路[12]。TLRs表達于各種免疫細胞，通過誘導(dǎo)分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、IL-6、IL-8細胞因子，同時上調(diào)NK細胞數(shù)量抵御病毒入侵[13]。BZLF1是EB病毒表達得即刻早期蛋白，在病毒感染早期，BALF1可下調(diào)TNF-α的表達，抑制機體抗病毒免疫反應(yīng)，利于病毒DNA復(fù)制[14]。IL-6和IL-8都是一種多效能的細胞因子，可以刺激造血干細胞、免疫細胞等的增殖，調(diào)節(jié)機體抗炎反應(yīng)，EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）能上調(diào)IL-6、IL-8和IL-10等細胞因子的表達，干擾宿主機體細胞因子分泌，從而調(diào)控免疫應(yīng)答反應(yīng)[15]。EBNA1是EB病毒核抗原的一種，可通過誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生抑制TLR信號通路激活，抑制抗原呈遞細胞活性，產(chǎn)生免疫逃逸。細胞免疫在在抗EB病毒感染過程中亦占有重要作用，EB病毒感染機體后，EB病毒抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）大量增值，激活CD8+T細胞、CD4+T細胞介導(dǎo)的細胞免疫，同時CTL可分泌大量的IFN-γ進一步發(fā)揮抗病毒作用。EB病毒可通過干擾抗原呈遞、干擾細胞因子作用，逃避宿主免疫，通過調(diào)節(jié)免疫抑制性因子IL-10，抑制IFN-γ細胞因子分泌，同時下調(diào)NK細胞和特異性CTL活力，調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-8等細胞因子的分泌影響宿主免疫應(yīng)答。

中醫(yī)學(xué)認為EB病毒屬于溫病邪氣，外感溫邪，傳變迅速，可侵及他臟。據(jù)臨床研究顯示，采用益氣養(yǎng)陰結(jié)合清熱解毒法，辯證用藥，可提高中藥治療EB病毒感染的療效。放療是鼻咽癌的主要治療手段，中醫(yī)學(xué)認為放射線屬于“火熱”毒邪，耗傷氣陰，故在使用中藥治療鼻咽癌合并EB病毒感染的患者時，不僅考慮采用清熱解毒藥物，也需配伍養(yǎng)陰清熱中藥，提高中藥抗病毒療效。普濟煎液采用普濟消毒飲為基礎(chǔ)化裁，配伍太子參、女貞子、玄參、生地黃益氣養(yǎng)陰藥物，扶正祛邪并重。方中黃芩、板藍根、牛蒡子、射干共為君藥，清熱解毒，利咽喉；僵蠶、貓爪草、夏枯草共為臣藥，有解毒散結(jié)、化痰軟堅之功效；陳皮、太子參、女貞子、玄參、生地黃為佐藥，其中陳皮理氣化痰，太子參、女貞子、玄參、生地黃益氣養(yǎng)陰；甘草為使藥，調(diào)和諸藥。全方配伍攻補結(jié)合，共奏解毒化痰、益氣養(yǎng)陰之功。

本實驗通過滴鼻、口腔接種EB病毒成功建立豚鼠感染EB病毒模型[23]，接種1周后通過股靜脈取血，分離外周血單個核細胞，并檢測到36只豚鼠細胞中有EB病毒復(fù)制，說明造模成功。予阿昔洛韋、普濟煎液灌胃2周后，與正常對照組比較，模型組、阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組中EBV-VCA IgG含量、外周血單個核細胞中EBV-DNA拷貝數(shù)升高。與模型組比較，阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組EBV-DNA拷貝數(shù)降低；高劑量普濟煎液組EBV-DNA拷貝數(shù)較阿昔洛韋組降低，提示阿昔洛韋、普濟煎液能有效抑制EBV-DNA復(fù)制。實驗發(fā)現(xiàn)各組豚鼠血清中IL-8含量比較無明顯差異，考慮普濟煎液可能不通過調(diào)節(jié)IL-8的分泌抑制EB病毒增殖。與模型組比較，阿昔洛韋組、低、高劑量普濟煎液組血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ含量升高，IL-10含量降低；高劑量普濟煎液組中TNF-α、IFN-γ含量較阿昔洛韋組升高，提示普濟煎液抑制EBV-DNA復(fù)制的機制可能是通過增加IL-6、TNF-α、IFN-γ的表達，降低血清中IL-10的表達，增強豚鼠免疫應(yīng)答效應(yīng)，抑制EB病毒增殖。