IVF促排卵不同卵巢反應(yīng)病人血清let-7的表達及意義

趙鴻娟，胡 賓，陳秀娟，王 煜

（1.山東省立第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟南 250000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心）

控制性超排卵（controlled ovrian hyperstimulation，COH）是輔助生殖技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，是為了一次獲取適當(dāng)數(shù)量及質(zhì)量的卵子，受精形成胚胎后植入宮腔，以提高妊娠的機率。卵巢儲備功能是女性生育能力的重要標(biāo)志，卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目隨年齡的增長不斷減少且質(zhì)量逐漸變差，即卵巢儲備功能逐漸下降。卵子的數(shù)量和質(zhì)量對IVF至關(guān)重要，一定的卵巢儲備功能是卵巢反應(yīng)的前提[1]。卵巢反應(yīng)性是指卵巢對促性腺激素的敏感程度，根據(jù)在促性腺激素（gonadotropin，Gn）作用下卵巢的反應(yīng)性，可分為卵巢低反應(yīng)、正常反應(yīng)及高反應(yīng)。卵巢對Gn刺激反應(yīng)不良的狀態(tài)，稱為卵巢低反應(yīng)。相反，當(dāng)卵巢對Gn的刺激異常敏感，超出了預(yù)期的范圍與合理水平時，則稱為高反應(yīng)，卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）是最常見的表現(xiàn)之一。卵巢低反應(yīng)和OHSS是目前導(dǎo)致IVF治療周期取消的主要原因，因此，正確評價卵巢對COH的反應(yīng)性，防止卵巢低反應(yīng)和OHSS的發(fā)生，成為生殖領(lǐng)域的研究熱點。

Let-7是卵巢中含量最豐富的miRNA之一，其在卵巢的不同發(fā)育時期和不同細(xì)胞中表達不同[2]，在維持卵巢正常功能與卵巢疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，例如，參與卵泡發(fā)育的調(diào)控、卵巢激素的合成與釋放、卵丘-卵母細(xì)胞間的信息交流[3]、卵巢癌細(xì)胞的發(fā)展等過程。

近年來，卵巢功能方面的研究越來越多，但對于卵巢反應(yīng)性的評估尚無明確標(biāo)準(zhǔn)。本文采用qRT-PCR法分別檢測卵巢高、中、低反應(yīng)組病人月經(jīng)期血清中l(wèi)et-7g、let-7f及l(fā)et-7i的表達水平，探討let-7g、let-7f及l(fā)et-7i可能參與調(diào)節(jié)卵巢生理的作用，初步評價其對IVF促排卵病人卵巢反應(yīng)性的預(yù)測價值，為臨床評價卵巢反應(yīng)性提供一條新的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2014-03～2015-11期間于醫(yī)院生殖中心因輸卵管因素或男方因素行IVF-ET的原發(fā)不孕病人40例，其中卵巢高反應(yīng)組14例、中反應(yīng)組14例、低反應(yīng)組12例，新鮮周期均移植。入選婦女年齡25～42歲，平均31.6歲，月經(jīng)規(guī)律，3個月內(nèi)未服用過激素類藥物，無不良生活嗜好。分別在常規(guī)長方案促排卵之前的月經(jīng)第二天，抽取外周血5mL，將上層血清提取，-80℃冰箱凍存待檢測。標(biāo)本采集均征得內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)及病人本人知情同意，所以標(biāo)本有完整病例資料。

卵巢反應(yīng)性分組參照：（1）卵巢高反應(yīng)組[4]（滿足以下任意兩項）：①總卵泡數(shù)14個或單側(cè)卵巢卵泡數(shù)＞10個或獲卵數(shù)＞15個；②人絨毛膜促性腺激素（HCG）日雌二醇（E2＞12000pmol/L或E2峰值＞75～90百分位[5]；③有OHSS史或因OHSS風(fēng)險致流產(chǎn)史；（2）卵巢中反應(yīng)組：介于卵巢高低反應(yīng)組之間，3個＜獲卵數(shù)＜14個；（3）卵巢低反應(yīng)組：2011年歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會年會上制定的博洛尼亞標(biāo)準(zhǔn)[6]，（滿足以下任意兩項）：①高齡（40歲）或存在卵巢反應(yīng)不良的其它危險因素；②前次IVF周期卵巢低反應(yīng)，常規(guī)方案獲卵數(shù)3個；③卵巢儲備下降（竇卵泡（AFC）<5～7個或抗苗勒氏管激素（AMH<0.5～1.1 ng/mL））。如果年齡或卵巢儲備功能檢測正常，病人連續(xù)兩個周期應(yīng)用最大化的卵巢刺激方案仍出現(xiàn)卵巢低反應(yīng)也可診斷。其他危險因素包括：影響卵巢儲備和對卵巢刺激反應(yīng)的遺傳或獲得性的疾病，如染色體的數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常、基因突變（如Turner綜合征等）；既往的盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫手術(shù)史、放化療（特別是烷基化的化療藥）史。

1.2 RT-PCR引物序列設(shè)計和合成：

為了使目標(biāo)基因歸一化，正確反映不同標(biāo)本的RNA產(chǎn)量和質(zhì)量，cDNA合成效率中的變化趨勢，結(jié)合本實驗的特點，選取了血清中表達穩(wěn)定的miR-16-5p作為內(nèi)參基因。所有引物設(shè)計軟件基于Gen Bank數(shù)據(jù)庫的let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p序列，設(shè)計特異擴增引物，引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。合成的引物序列如下：

基因let-7g let-7f let-7i miR-16-5p上游引物序列（5'-3'）CCGCGTGAGGTAGTAGTTTGTACAGTTAAA GCGCGCTGAGGTAGTAGATTGTATAGTTAAA CGGCTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTTAA UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG下游引物序列（5'-3'）GTGCAGGGTCCGAGCT GTGCAGGGTCCGAGCT GTGCAGGGTCCGAGCT GTGCAGGGTCCGAGCT

1.3 定量PCR檢測let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p的表達水平

1.3.1 總RNA提取取出保存的上層血清制備總RNA，RNA提取試劑購自寶生物工程（大連）有限公司Takara，根據(jù)說明書提取總RNA，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RNA的純度及質(zhì)量鑒定紫外線分光光度計檢測提取總RNA的吸光度（A）值，A260/A280值在1.8～2.1可進行下一步實驗，并用瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3.3 let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p的檢測 以RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，獲得互補DNA，反轉(zhuǎn)錄試劑購自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃60 min；85℃5s，采用實時熒光定量PCR試劑盒（Takara公司）擴增let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p，熒光定量PCR儀（美國Bio-rad 7300公司）行定量PCR，反應(yīng)參數(shù)為95℃30s，預(yù)變性95℃5s，60℃30s，溶解曲線分析95℃15s熒光檢測1次，共40個循環(huán)，記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），若未檢測到Ct值或復(fù)孔間Ct值之差>1，需要重復(fù)實驗。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)溶解曲線分析產(chǎn)物是否單一，每組均設(shè)3個復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用單因素方差分析。顯著性檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 統(tǒng)計數(shù)據(jù)

Let-7g、let-7f及l(fā)et-7i在中反應(yīng)組病人血清中表達量最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014、P=0.001、P=0.008）；高反應(yīng)組病人血清中l(wèi)et-7f的表達量高于低反應(yīng)組病人，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.028）；let-7g、let-7i在高反應(yīng)組及低反應(yīng)病人血清中的表達無顯著差異（P=0.704、P=0.310）。

2.2 臨床特征

體重指數(shù)：三組病人體重指數(shù)無明顯差異（P=0.403）；年齡：卵巢低反應(yīng)組病人明顯比中、高反應(yīng)組大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.034）；Gn天數(shù)：卵巢低反應(yīng)組病人明顯比中、高反應(yīng)組病人用藥時間長（P=0.001）；Gn總量：低反應(yīng)組病人比中、高反應(yīng)組病人用量大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），余兩組間無明顯差異（P=0.173）；基礎(chǔ)FSH水平：低反應(yīng)組比高反應(yīng)組水平高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.008），而低、中反應(yīng)組及中、高反應(yīng)組之間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.091、P=0.264）；FSH/LH比值：低反應(yīng)組比值＞2，且高于其余兩組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），余兩組組間無明顯差異（P=0.163）；AMH：卵巢低、中、高反應(yīng)組中呈上升趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.437）；AFC：卵巢低、中、高反應(yīng)組中呈上升趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.145）獲卵數(shù)：卵巢低、中、高反應(yīng)組病人逐漸增加，三組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）；新鮮周期胚胎移植后妊娠率：三組病人分別25.0%、57.14%和42.86%。

3 討論

近期國外研究發(fā)現(xiàn)，let-7a、b、d、f、h在團頭魴卵巢發(fā)育I期至V期逐漸升高，VI期顯著下降，let-7可能在其卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用[7]。本實驗團隊前期高通量測序的技術(shù)分析早期流產(chǎn)蛻膜和正常早孕蛻膜中mi RNAs的表達譜顯示[8]，let-7家族高豐度表達，qRT-PCR顯示let-7f、let-7g和let-7i在流產(chǎn)蛻膜中的表達顯著低于早孕蛻膜中的表達，let-7i在早孕蛻膜中表達顯著升高[9]，這些都提示let-7可能參與早期流產(chǎn)。

IVF中，年齡大的病人COH時間長，因?qū)n的反應(yīng)性下降而使用量增多，胚胎的著床率及妊娠率降低，妊娠后流產(chǎn)、早產(chǎn)及子代染色體異常幾率也增高[10]。Chuang[11]等研究認(rèn)為，年齡是妊娠率的獨立預(yù)測因子，女性的生育潛能與年齡密切相關(guān)，35～41歲女性不孕的概率比30～35歲女性增加一倍。本研究中卵巢低反應(yīng)組病人明顯比其余兩組病人大、Gn天數(shù)長、Gn總量也最多，結(jié)果與上述描述相符。由于個體間存在差異，且女性生理年齡常常與卵巢功能不完全相符，因此，實際年齡預(yù)測結(jié)果有出入，應(yīng)結(jié)合其他預(yù)測指標(biāo)綜合評估。

生理狀態(tài)下，隨卵巢功能的下降，卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）水平升高。在卵巢反應(yīng)不良病人中，F(xiàn)SH的水平升高，導(dǎo)致卵泡生長及消耗加快，加速卵巢功能的衰竭。本研究中，卵巢低反應(yīng)組病人基礎(chǔ)FSH水平最高。而在一項回顧性研究中[12]，對689例IVF病人以獲卵數(shù)為依據(jù)將病人分為低反應(yīng)（0～3枚）、中反應(yīng)（4～15枚）及高反應(yīng)（16枚以上）三組，根據(jù)血清FSH的水平為指標(biāo)預(yù)測卵巢的反應(yīng)性，結(jié)果顯示FSH作為預(yù)測因子是有限的。本研究中卵巢低反應(yīng)組病人FSH/LH＞2，且高于中、高反應(yīng)組病人，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，目前影響卵巢儲備功能和卵巢反應(yīng)性的基礎(chǔ)血清FSH/LH比值的閾值目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，文獻報道從＞2.0～3.6不等[13]。

AMH屬于β2轉(zhuǎn)化生長因子家族的糖蛋白，2015年荷蘭的一項大型觀察性研究得出結(jié)論，干預(yù)前AMH能準(zhǔn)確預(yù)測使用促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑方案者的卵巢反應(yīng)性，AMH＞4.5ng/mL提示卵巢反應(yīng)性好，而且AMH＜0.8ng/mL則提示卵巢無反應(yīng)[14]。目前多項研究認(rèn)為直徑2-6 mm的AFC數(shù)目更能定量直接的反映卵巢儲備功能。AFC減少，尤其是 9h，在預(yù)測卵巢低反應(yīng)時，敏感度為84%，特異度為79%[15]。在本研究中，卵巢低、中、高反應(yīng)組中，血清中AMH水平呈上升趨勢。目前尚無能夠獨立評價卵巢儲備功能的特異性標(biāo)志物，應(yīng)考慮個體差異，通過聯(lián)合多種指標(biāo)進行評估，除上述外，還有獲卵數(shù)、HCG注射日血清E2峰值、抑制素B、卵巢體積及卵巢基質(zhì)血流等。

研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育中，miR-143、let-7a和miR-125b的表達可被FSH抑制[16]。let-7c在始基卵泡中的表達很少，在初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡中持續(xù)表達[17，18]，其主要存在于顆粒細(xì)胞中[19]，顆粒細(xì)胞可促使卵巢周圍微血管的生成。let-7c在MⅠ期卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞中的表達明顯高于MⅡ期。let-7c的水平增加，卵母細(xì)胞的成熟率升高[20]，這提示let-7c參與卵母細(xì)胞與周圍顆粒細(xì)胞的相互作用。let-7b可通過轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響雌激素的分泌[21]。let-7c的表達可被雄激素（A）抑制，使用抗A藥物可解除let-7c的表達抑制，并緩解A介導(dǎo)的細(xì)胞增生，而let-7c可通過抑制雄激素受體（AR）的轉(zhuǎn)錄過程從而抑制AR的表達及其活性[22]。多囊卵巢綜合征（PCOS）病人存在高雄激素血癥，Ding等[23]檢測病人血清mi RNA發(fā)現(xiàn)，let-7c的表達下調(diào)。

本研究中，卵巢低、中、高反應(yīng)組病人獲卵數(shù)依次升高，而中反應(yīng)組新鮮周期胚胎移植后的妊娠率最高，低反應(yīng)組最低。qRT-PCR結(jié)果顯示，卵巢中反應(yīng)組病人血清中l(wèi)et-7g、let-7f及l(fā)et-7i在相對表達量最高，提示基礎(chǔ)血清中l(wèi)et-7g、let-7f及l(fā)et-7i的表達水平可能與IVF病人卵巢反應(yīng)及其妊娠結(jié)局有一定相關(guān)性。

Let-7與女性內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)、卵泡發(fā)育之間存在一定的相互作用，因此而影響卵巢功能。我們的研究是相對較小的病人群，雖然研究結(jié)果顯示let-7的表達存在差異，但顯然需要進一步擴大樣本量或改變COH方案等方面進行研究，探討let-7是否可能作為IVF病人卵巢反應(yīng)性的預(yù)測因子。