反向遺傳學(xué)技術(shù)在麻疹病毒屬病毒中的研究進(jìn)展

石曉玲，和偉程，潘曉梅，田永強(qiáng)，柏家林

(1.蘭州交通大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

麻疹病毒屬屬于副黏病毒科副黏病毒亞科，包括麻疹病毒(Measles virus,MV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)、牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)、海豹瘟病毒(Phocine distemper virus,PDV)、鯨類動(dòng)物麻疹病毒(Cetacean morbillivirus,CeMV)和小反芻獸疫病毒(Pestedespetitsruminants virus,PPRV).麻疹病毒屬病毒的核酸為單股負(fù)鏈RNA，基因組不分節(jié)段，長約16 kb，編碼六個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)膜蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝蛋白(Hemagglutinin，H)、大蛋白(Large virus-specified RNA polymerase protein,L)和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白C和V，順序?yàn)镹-P-M-F-H-L.牛瘟病毒雖然已經(jīng)被消滅，但麻疹病毒、小反芻獸疫病毒和犬瘟熱病毒對(duì)動(dòng)物及人的危害仍然很大，反向遺傳學(xué)操作為解決這一難題提供了較為可靠的技術(shù)保障. 反向遺傳學(xué)技術(shù)是相對(duì)于經(jīng)典遺傳學(xué)研究而言，主要通過構(gòu)建RNA病毒的感染性克隆，在cDNA水平上進(jìn)行體外操作(如核苷酸序列的突變、缺失、插入等)，然后通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得子代病毒，進(jìn)而對(duì)病毒基因結(jié)構(gòu)、功能，以及表型性狀等方面進(jìn)行研究的方法.因此，又被稱為“病毒拯救(the rescue of virus)”[1].1978年Taniguchi等首次在基因水平上進(jìn)行遺傳修飾，構(gòu)建出Qβ噬菌體，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌完成了病毒的復(fù)制周期[2]，之后這一技術(shù)又被應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒[3].1994年Conzelmann等針對(duì)負(fù)鏈RNA病毒狂犬病病毒(Rabies virus，RV)基因組構(gòu)建了一個(gè)能夠高效表達(dá)外源基因的表達(dá)載體[4]，這些工作均為病毒RNA的結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ).如今，大多數(shù)病毒都成功建立了各自的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，并已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域.本文綜述了反向遺傳學(xué)技術(shù)在麻疹病毒屬病毒基因結(jié)構(gòu)與功能、致病機(jī)制、感染性克隆構(gòu)建及新型疫苗研制等方面的研究進(jìn)展.

1 反向遺傳學(xué)在麻疹病毒研究中的進(jìn)展

早在公元7世紀(jì)，就有該病的記載，并被稱為“比天花要可怕得多”的疾病.1954年Enders和Peebles首次分離出該病毒.在麻疹病毒屬中，其應(yīng)用最為成熟和廣泛.1995年，Radecke等成功建立第一個(gè)麻疹病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，且應(yīng)用于標(biāo)記疫苗.通過篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，拯救了子代病毒，發(fā)現(xiàn)有三個(gè)核苷酸突變，又將F蛋白的5'UTR中缺失504個(gè)核苷酸，均與Edmonston B(Ed)株的復(fù)制行為相似[5]；Schneider等在噬菌體的痘病毒載體中，限制了T7 RNA聚合酶的表達(dá)，這為研發(fā)新型麻疹疫苗奠定了基礎(chǔ)[6].此后，MV拯救系統(tǒng)逐漸興起.

Parks等顯著提高了拯救效率，將轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞和Vero細(xì)胞共培養(yǎng)，或共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進(jìn)行加溫處理[7].以上均以Ed株為基礎(chǔ)進(jìn)行的改造.直至2000年日本的科學(xué)家在B95a 細(xì)胞中拯救IC-B 毒株，為高致病性毒株的拯救帶來了希望[8].2005年發(fā)現(xiàn)了高效的逆轉(zhuǎn)錄基因系統(tǒng)，在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)SLAM，獲得較高的拯救效率[9].次年開發(fā)了一個(gè)包含多個(gè)外源轉(zhuǎn)錄單元的拯救系統(tǒng)，為研究負(fù)鏈RNA病毒中外源基因的插入與否提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[10].迄今為止，在麻疹病毒屬中MV的拯救系統(tǒng)研究最廣泛，這也為麻疹病毒屬病毒的研究、疫苗開發(fā)及其他研究奠定了基礎(chǔ).反向遺傳學(xué)作為一種研究方法，以病毒致病機(jī)理、疫苗研發(fā)、基因治療等在麻疹病毒中應(yīng)用最多，還有其他應(yīng)用，但并不成熟.

為了驗(yàn)證非結(jié)構(gòu)蛋白C和V是否對(duì)MV增殖的影響，構(gòu)建了衍生株MV C-Ed，其中C蛋白的編碼區(qū)以點(diǎn)突變的方式進(jìn)行基因沉默，拯救的突變體可在細(xì)胞中增殖，且沒有其他顯著變化[11].Patterson J B 等驗(yàn)證了缺失重組體MV(C-)和(V-)與親本疫苗株Ed在Vero細(xì)胞中都具有生長特征和病變效應(yīng).在體內(nèi)，都以相同劑量(10-3)接種小鼠，10～15天后，Ed株小鼠死亡，而MV C-或MV V-有溫和的臨床癥狀和低的死亡率.免疫組化顯示MV C-和MV Ed有相似程度的擴(kuò)散，但限制了MV V-在整個(gè)腦中的擴(kuò)散.因此MV C-和V- 蛋白在體內(nèi)通過不同的機(jī)制起作用[12].張勇俠等通過改造麻疹病毒S191株，并在基因間插入GFP，獲得拯救病毒，將二者共轉(zhuǎn)染BSRT7細(xì)胞，熱休克后感染Vero-SLAM細(xì)胞系，成功拯救到兩種有活性的病毒[13]；王健等用全基因合成方法獲得麻疹減毒活疫苗S191，共轉(zhuǎn)染293T-3-46 細(xì)胞系拯救出麻疹病毒[14]；汪一龍等在BHK-SR19-T7細(xì)胞共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法成功對(duì)S191株進(jìn)行了拯救，同時(shí)研發(fā)成功了mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷疫苗株[15]，為今后研發(fā)新型麻疹疫苗提供了新方向.

為探究嵌合麻疹病毒，將MV Schwar疫苗株F和H被猿類免疫缺陷病毒SIVmac239株的gp160包膜蛋白取代.利用CD4+靶細(xì)胞，在高滴度時(shí)，病毒形態(tài)與親本MV顆粒相同.改變了病毒從CD46+細(xì)胞向CD4+細(xì)胞的趨向性.這得益于HIV樣趨向性和MV在樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中復(fù)制的能力，可作為HIV候選疫苗[16].胡孔新等用MV敏感細(xì)胞系B95a，建立CC- 47株麻疹病毒的有功能的RNP，從而獲得拯救病毒，連續(xù)傳代，仍能檢出病毒抗原和核酸[17]；修梅紅等發(fā)現(xiàn)提高拯救麻疹病毒微復(fù)制子效率，并構(gòu)建了Vero細(xì)胞系.將反向插入報(bào)告基因的微復(fù)制子感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)均能表達(dá)[18]，這為發(fā)展病毒載體提供了技術(shù)平臺(tái).

Singh M等將白細(xì)胞介素12(IL-12)的2個(gè)亞基P35和P40基因插入到麻疹毒基H和L基因序列之間，進(jìn)行拯救且傳代培養(yǎng)10代，仍穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)MV的復(fù)制不受影響.證實(shí)MV可用來表達(dá)外源基因進(jìn)行免疫預(yù)防和基因治療[19].Muhlebach MD將病毒基因組各自的抗基因組以及核糖核蛋白復(fù)合物的所有蛋白質(zhì)克隆到MV疫苗株中進(jìn)行拯救，然后在適當(dāng)?shù)呐R床動(dòng)物模型中評(píng)估它們的免疫原性[20].

2 反向遺傳學(xué)在犬瘟熱病毒研究中的進(jìn)展

CDV于1905年首次發(fā)現(xiàn)，直到2000 年，Gassen等用Onderstepoort(OP)株在HeLa細(xì)胞中，拯救出與母本毒株相似生長特性的病毒[21]，為CDV的結(jié)構(gòu)和功能及新型疫苗載體的研究奠定了基礎(chǔ).盡管CDV的反向遺傳操作系統(tǒng)建立的較早，但應(yīng)用相對(duì)集中，主要為嵌合病毒和標(biāo)記疫苗.

Parks CL等在全長基因中插入熒光素酶外源基因，成功構(gòu)建了表達(dá)熒光素酶的rCDV[22]；Fujita等用同樣的方法，感染多種宿主細(xì)胞.隨著侵染B95細(xì)胞的變化，對(duì)SLAM受體的影響更顯著；但侵染HEK293細(xì)胞時(shí)，磷脂樣蛋白的表達(dá)反而降低，同時(shí)CDV的感染效率也下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了磷脂樣蛋白介導(dǎo)感染細(xì)胞是通過F、H蛋白與磷脂樣蛋白的穩(wěn)定結(jié)合來發(fā)揮作用的[23].Plattet P等對(duì) A75/17 株插入EGFP 基因[24]；同樣，SiLin D等在CDV 的L蛋白中插入EGFP基因，導(dǎo)致病毒不能正常復(fù)制，證明了EGFP基因的插入使病毒顯著致弱，且產(chǎn)生中和抗體，為新型疫苗的研究提供了新的方向[25]；閆小更等成功拯救rCDV11在Vero細(xì)胞上，同時(shí)研究了EGFP基因插入不同位置對(duì)病毒復(fù)制的影響，證明了在P-M基因之間插入，能穩(wěn)定、高效地表達(dá)，并且具有良好的遺傳穩(wěn)定性[26]，為標(biāo)記疫苗的研究奠定了基礎(chǔ).李丹丹等成功構(gòu)建了CDV-SH株的感染性克隆[27]；李智麗在BHK-T7細(xì)胞系成功拯救病毒.將狂犬病毒Flury-LEP株G蛋白和水貂腸炎細(xì)小病毒VP2蛋白基因插入病毒基因組，拯救重組病毒并探究作為活病毒疫苗載體的能力[28].

Messling等用OP 疫苗株，將CDV的5804、OS和OL株和MV Ed的H蛋白互換，研究了重組病毒與親本株在融合原性、生長特性及趨向性的差異，證實(shí)H基因?qū)Σ《镜乃拗骷?xì)胞嗜性和致病性起著重要作用[29].Plattet P等將CDV的OP株與A75/17株的F、H、F+H基因進(jìn)行了互換，并在Vero、Vero-SLAM細(xì)胞中評(píng)價(jià)融合性，表明細(xì)胞融合過程中F基因有顯著作用.此外，SLAM受體也有促進(jìn)作用[30]；Dietzel等將CDV病毒的OP株的M基因與5804P株的相應(yīng)基因互換，重組病毒在Vero-SLAM細(xì)胞上生長顯著增加，也影響了細(xì)胞膜中病毒囊膜糖蛋白的分布，使病毒粒子減少，單位時(shí)間內(nèi)的生長滴度也降低.同期證明重組病毒能使雪貂產(chǎn)生輕微的癥狀，驗(yàn)證了M蛋白在病毒弱化方面產(chǎn)生了很大的作用[31]；Wang X等制備了表達(dá)狂犬病毒糖蛋白(RVG)的疫苗株.重組病毒在Vero細(xì)胞培養(yǎng)與親本株有相似的生長特性.經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明rCDV-RVG對(duì)小鼠和犬是安全的，可誘導(dǎo)對(duì)RABV和CDV產(chǎn)生強(qiáng)而持久的病毒中和抗體應(yīng)答.首次研究表明，重組CDV有潛力作為動(dòng)物狂犬病和犬瘟熱的二價(jià)活疫苗[32].

3 反向遺傳學(xué)在牛瘟病毒研究中的進(jìn)展

牛瘟早在公元 4 世紀(jì)中國就有記載.2011年，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織正式宣布，牛瘟病毒已成功被人類消滅.1997年Baron M D等用表達(dá)T7RNA聚合酶的操作系統(tǒng)，成功拯救出牛瘟病毒的全基因組序列，獲得RBOK疫苗株[33]，證明了該技術(shù)在牛瘟病毒中成功應(yīng)用，并為今后反向遺傳學(xué)技術(shù)在牛瘟病毒中提供了技術(shù)平臺(tái).

Banyard等在RPV基因組中插入EGFP基因，實(shí)時(shí)觀察重組病毒的復(fù)制情況，揭示了病毒在受感染動(dòng)物的不同組織中的復(fù)制過程[34]，也為PRV的標(biāo)記疫苗提供了有力驗(yàn)證.

Das S C等成功制備了嵌合疫苗.用PPRV的F和H基因替換RPV的相應(yīng)基因，其中用T7 RNA聚合酶和重組禽痘病毒在Vero細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)僅替換一種基因時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)病變，但同時(shí)替換F和H基因時(shí)，病毒特異性功能將會(huì)聯(lián)合作用，表明F和H基因同時(shí)存在時(shí)，可成功拯救牛瘟病毒.免疫山羊后，可保護(hù)山羊免受PPRV攻擊，并成為理想的PPRV疫苗株[35].同樣，ParidaS等也拯救了嵌合病毒.RPV N基因開放閱讀框被PPRV N基因替換，免疫牛后，并未發(fā)生副作用.另外，將RPV的N蛋白的C 端可變區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，制備蛋白，免疫動(dòng)物，通過標(biāo)記疫苗來區(qū)分疫苗毒和野毒的感染[36].

4 反向遺傳學(xué)在小反芻獸疫病毒研究中的進(jìn)展

小反芻獸疫病毒在1942年首次被發(fā)現(xiàn)，它是類似于牛瘟的一種疾病.1979年被列為麻疹病毒屬的第4個(gè)成員[28].在成功消滅牛瘟病毒之后，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)制定了到2030年在全球范圍內(nèi)消滅小反芻動(dòng)物(PPR)的目標(biāo).為了支持根除計(jì)劃，我們用反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)PPRV核酸水平進(jìn)行了改造，以探究病毒基因結(jié)構(gòu)和功能等，對(duì)子代病毒的感染性和遺傳特性的影響.小反芻獸疫病毒微型基因組系統(tǒng)于2007年被發(fā)現(xiàn)[37]，證明了PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)的可行性，也為PPRV的各項(xiàng)研究提供了新的平臺(tái).但是，該方法還不成熟、不完善.因而在該病毒的應(yīng)用中并不多，其主要集中在嵌合病毒和標(biāo)記疫苗方面的研究.

胡倩倩首次建立了表達(dá)GFP的重組PPRV，與親本毒在體外復(fù)制能力、免疫原性等方面沒有明顯區(qū)別，且該病毒可穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白[38]；Muniraju M等通過突變H蛋白三個(gè)氨基酸，在體外與野生株對(duì)比并沒有顯著變化，但在體內(nèi)評(píng)估后，H突變體在山羊體內(nèi)提供了充分的保護(hù)[39].近期，Liu,F等在體外高效表達(dá)eGFP，并根據(jù)重組PPRV的綠色熒光跟蹤特性，選擇8個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，鑒定其對(duì)PPRV感染的敏感性.結(jié)果表明，僅比較8個(gè)細(xì)胞單層中綠色熒光細(xì)胞的比例，Vero和PK15細(xì)胞系對(duì)其感染的敏感性最高和最低[40].這為今后研究PPRV致病機(jī)理及PPRV為載體的新型疫苗研究奠定了基礎(chǔ).

該病毒是傳遞免疫原性蛋白的理想疫苗載體.2012年研制了藍(lán)舌病、小反與獸疫二聯(lián)活疫苗.通過構(gòu)建表達(dá)藍(lán)舌病毒VP5和VP7蛋白的重組PPRV，且接種山羊可誘導(dǎo)產(chǎn)生PPRV和BTV的抗體[38]；Yin C等構(gòu)建了表達(dá)亞洲I型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白的重組PPRV病毒，接種山羊可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，表達(dá)FMDV VP1蛋白的重組PPRV是針對(duì)PPRV和FMDV的潛在雙活體載體疫苗[41]；Liu,F等在體外拯救重組SRMV表達(dá)顆粒狀EG95抗原.雖然比親本病毒復(fù)制速度慢，但可以在細(xì)胞中有效表達(dá)EG95抗原.如果在未來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能誘導(dǎo)對(duì)這兩種疾病的有效免疫反應(yīng)，將會(huì)成為雙價(jià)疫苗的潛在候選[42].以上為今后研發(fā)安全有效的二聯(lián)活疫苗奠定了基礎(chǔ). 翟軍軍等制成DNA疫苗，基因組進(jìn)行克隆最終連接至pok12載體，并免疫山羊，說明DNA疫苗和弱毒疫苗一樣能夠誘導(dǎo)山羊產(chǎn)生特異性反應(yīng)[1]；Muniraju M從北非分離出的Morocco/2008株，并用體外轉(zhuǎn)錄的方法進(jìn)行拯救[43]，為PPR新型疫苗的研制提供了新的思路和方向.

5 展望

綜上所述，近年來，國內(nèi)外多數(shù)科研平臺(tái)先后建立了動(dòng)物RNA病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，技術(shù)層面更加簡便高效.其中此方法對(duì)麻疹病毒屬病毒進(jìn)行有目的地改造，使病毒的生長周期和致病性、基因組的結(jié)構(gòu)與功能、新型疫苗和載體構(gòu)建等方面的研究有了很大改進(jìn).相信以后還會(huì)不斷有新發(fā)現(xiàn)或新改造的生物載體，獲得更理想的重組病毒，而達(dá)到擴(kuò)大反向遺傳操作技術(shù)應(yīng)用的廣度和深度.