蓯蓉益腎顆粒治療糖尿病腎病的潛在作用機制

蔡文璽，李 浩，石 磊，張 磊

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病，尤其是2型糖尿病所致的慢性腎臟疾病，是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，最終可發(fā)展為終末期腎病 (end-stage renal disease，ESRD)[1-2]。根據(jù)2019中國糖尿病腎病防治指南，與未合并DN的糖尿病患者相比，DN患者的死亡率更高，且大部分死亡是由于心血管事件導致[3]。然而，盡管一些治療方法可以緩解糖尿病腎病的癥狀，包括嚴格控制血糖、血壓，給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)等，但療效仍不理想[4，5]。而作為中藥復方制劑的蓯蓉益腎顆粒主要由五味子、菟絲子、肉蓯蓉、茯苓、車前子、巴戟天等中草藥制成，具有補腎填精之功效[6-8]，在DN的治療中有著積極的作用，但是其主要藥效成分、作用機制仍不明確。本研究基于網(wǎng)絡藥理學策略，預測了蓯蓉益腎顆粒治療DN的作用機制，揭示藥物與生物系統(tǒng)相互作用的內(nèi)涵，有助于理解中藥整體的多靶點、多途徑網(wǎng)絡的協(xié)同調(diào)控模式，為中藥活性成分的篩選及其多靶點作用機制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蓯蓉益腎顆粒主要化學成分的收集和篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP)[9]，以 “五味子”、“菟絲子”、“肉蓯蓉”、“茯苓”、“車前子”、“巴戟天”為關(guān)鍵詞檢索蓯蓉益腎顆粒中的化學成分。結(jié)合藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄的相關(guān)性質(zhì)及TCMSP中建議的篩選標準，以口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18為限制進行活性成分的篩選。

1.2 蓯蓉益腎顆粒主要化學成分潛在作用靶點的收集 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索上述所有候選活性成分對應的靶點信息，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫進行進一步篩選，通過輸入靶蛋白名稱，并限定物種為“Homo sapiens”，剔除非人源靶點，將所有蛋白名校正為其官方名稱。

1.3 DN疾病靶點的收集 以“diabetic nephropathy”、“diabetic kidney disease”為關(guān)鍵詞分別檢索TTD[10], OMIM[11], DisGeNET[12], Drugbank[13], PharmGkb[14], CTD[15], Genecard[16]等數(shù)據(jù)庫，去除重復基因，得到疾病對應的靶點數(shù)據(jù)集。

1.4 生物分子網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 基于上述靶點信息，通過Cytoscape 3.7.1[17]軟件構(gòu)建中藥-成分、主要成分-靶點網(wǎng)絡，從而顯示中藥多成分、多靶點的作用特點。

比對主要活性成分靶點和疾病靶點，確定靶點交集，借助STRING v10.5數(shù)據(jù)庫[18]構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡，尋找靶點和靶點間作用關(guān)系。通過Network Analyzer對PPI網(wǎng)絡進行網(wǎng)絡拓撲特性分析，包括度、介數(shù)中心度(betweenness centrality, BC)和接近中心度(closeness centrality, CC)，選取大于上述參數(shù)中位數(shù)的靶點作為關(guān)鍵靶點，其在網(wǎng)絡中信息傳遞效率更高，能影響更多節(jié)點，在網(wǎng)絡中作用顯著。

1.5 信號通路富集分析 采用Cytoscape 3.7.1軟件插件ClueGO[19]對上述靶基因進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析，綜合預測蓯蓉益腎顆粒與DN關(guān)鍵靶點的生物學過程及調(diào)控通路，基于富集結(jié)果的P值，以P<0.05為篩選條件，P<0.01被認為是顯著富集，根據(jù)從小到大的順序?qū)值進行排序。

2 結(jié) 果

2.1 蓯蓉益腎顆粒主要化學成分的收集和篩選 首先，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對蓯蓉益腎顆粒主要化學成分進行檢索，根據(jù)OB(≥30%)與DL(≥0.18)閾值，最終共得出69個活性成分(圖1)。其中，五味子8個，菟絲子11個，肉蓯蓉6個，茯苓15個，車前子9個，巴戟天20個，見圖1。

圖1 蓯蓉益腎顆粒主要化學成分網(wǎng)絡

2.2 蓯蓉益腎顆粒主要化學成分潛在作用靶點的收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到蓯蓉益腎顆?；瘜W成分對應的1117個作用靶點，其中五味子30個，菟絲子343個，肉蓯蓉223個，茯苓30個，車前子195個，巴戟天296個，通過Cytoscape3.7.1軟件將蓯蓉益腎顆粒主要化學成分與靶點相連，繪制出“中藥活性成分-潛在作用靶點”可視化相互作用網(wǎng)絡圖。

該網(wǎng)絡由269個節(jié)點和549條邊組成，且普遍存在1個活性成分作用于多個靶點以及多個活性化學成分對應1個靶點的現(xiàn)象，從而說明了蓯蓉益腎顆粒治療作用的多靶點屬性。而潛在靶點PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1、PIK3CG等因較高的自由度在網(wǎng)絡中發(fā)揮著重要作用，這也表明了蓯蓉益腎顆粒在發(fā)揮藥效過程中不同成分間的綜合協(xié)同作用模式。

2.3 DN疾病靶點的收集 通過TTD、OMIM、DisGeNET、Drugbank、PharmGkb、CTD、Genecard數(shù)據(jù)庫收集DN相關(guān)靶點基因，去除重復基因，共得到311個疾病對應的靶點數(shù)據(jù)集。

2.4 生物分子網(wǎng)絡構(gòu)建及分析 比對主要活性成分靶點和疾病靶點，取其靶點交集，共得到81個活性成分和DN疾病共有靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI，尋找靶點和靶點間作用關(guān)系。通過Network Analyzer對PPI網(wǎng)路進行分析得，BC中位數(shù)為0.002827，CC中位數(shù)為0.6093，度的中位數(shù)為30.5?；诰W(wǎng)絡藥理學篩選方法，篩選上述拓撲學參數(shù)值大于中位數(shù)的靶基因作為關(guān)鍵靶點，共37個，見表1。

2.5 信號通路富集分析 采用ClueGO插件對上述關(guān)鍵靶基因進行GO和KEGG信號通路富集分析，綜合預測蓯蓉益腎顆粒與DN關(guān)鍵靶點的生物學特性及調(diào)控通路。

GO富集分析表明，蓯蓉益腎顆粒可能通過對脂多糖的反應、對活性氧的反應、氧化應激、凋亡、細胞增殖等352個顯著生物過程發(fā)揮作用。KEGG功能注釋富集分析提示，該中藥復方可能作用的信號通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、癌癥途徑、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡等94個。上述信息表明，蓯蓉益腎顆粒可通過調(diào)節(jié)多個生物過程及多個通路的協(xié)調(diào)發(fā)揮治療DN的作用。同時，KEGG富集顯示疾病之間的調(diào)控機制存在相互聯(lián)系、相互影響的關(guān)系。富集分析表明，包括不同類型的病毒感染、乙型肝炎、恰加斯病(美國錐蟲病)、百日咳、弓形蟲病等疾病也被顯著富集。進一步對KEGG富集分析結(jié)果進行可視化處理。

表1 蓯蓉益腎顆粒治療DN關(guān)鍵靶點

3 討 論

DN是糖尿病患者最重要的合并癥之一，目前已成為終末期腎臟病的第二位原因，僅次于腎小球腎炎。中醫(yī)理論認為，DN歸屬為中醫(yī)“消渴”、“水腫”等范疇，其基本病機為氣陰兩虛，消渴日久，燥熱傷陰，陰損及陽。故在治療上多以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀等方法進行治療[20]。中藥復方蓯蓉益腎顆粒主要由肉蓯蓉、五味子、菟絲子、茯苓、車前子、巴戟天等中草藥制成。其中，肉蓯蓉甘酸咸溫，既能補腎壯陽，又能益精填髓，為君藥；巴戟天辛甘微溫，補益腎氣，強筋壯骨，菟絲子辛甘平，滋補腎陰，固精養(yǎng)血，滋補腎陰，二者共為臣藥，增強肉蓯蓉之補益腎氣之力，特別是菟絲子多糖還具有較好的降血糖作用[21]；五味子能斂肺益腎，固攝精微，茯苓甘平，健脾滲濕利水，二者合而為佐藥；車前子甘寒通淋，利水消腫，以制五味子、菟絲子過于澀精，且引諸藥入腎，為使藥；全方共奏補腎填精，滋陰補氣之功效。

本研究旨在探索蓯蓉益腎顆粒潛在的分子生物學機制，通過比對主要活性成分靶點和疾病靶點，構(gòu)建主要成分靶點與DN疾病靶點交集的PPI網(wǎng)絡，最終篩選得到37個關(guān)鍵靶點，包括AKT1、IL-6、TNF、VEGFA等。有研究表明，AKT1是細胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)中重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其異常表達和激活可引起過度的細胞外基質(zhì)在間質(zhì)沉積，啟動并維持DN慢性腎纖維化發(fā)生發(fā)展[22]； IL-6、TNF-α及VEGFA是2型糖尿病腎病發(fā)生的重要炎癥反應介質(zhì)，病理情況下，高水平的VEGFA及 IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放過度，造成了腎小球病理變化加劇，其組織功能和結(jié)構(gòu)也發(fā)生了異常變化[23]。

生物過程及信號通路富集共篩選出94條顯著信號通路及352個顯著生物過程，表明蓯蓉益腎顆粒可能通過對炎癥反應、對活性氧的反應、氧化應激、凋亡、細胞增殖等生物過程，以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、癌癥途徑、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡等多個信號通路協(xié)同發(fā)揮治療DN的作用，這些信號通路及生物過程目前已經(jīng)證明與DN相關(guān)。AGE-RAGE信號通路是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要一環(huán)，其在糖尿病腎病中的作用機制體現(xiàn)在激活NF-κB，引起大量黏附分子、生長因子、促炎細胞因子(如IL -6、IL-8、TNF-α) 等的表達和釋放，最終引起慢性細胞活化和組織損傷[24]，該通路還可刺激產(chǎn)生VEGF，從而增加血管的通透性，引起蛋白尿。而DN是一種代謝紊亂引起的炎性反應疾病，炎癥因子的釋放增多可促進巨噬細胞浸潤，腎小管纖維化，最終導致腎小球硬化加速[25]。其中，TNF-α 是一種重要的多功能免疫細胞因子，參與許多炎性、傳染性和自體免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[26]。它還可以刺激內(nèi)皮細胞和單核細胞分泌IL-6、IL-1β等炎癥因子，從而進一步放大或間接增強其毒性作用[27]。 臨床研究結(jié)果顯示，蓯蓉益腎顆粒在降低血糖的同時，可顯著降低患者血清TNF-α、IL-6等炎癥因子水平[6]。這也佐證了蓯蓉益腎顆?？赡苁峭ㄟ^干預人體AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路，參與到炎性反應生物過程來控制和改善DN患者的病情。

另外，生物過程和信號通路富集分析顯示，蓯蓉益腎顆粒也可以參與到對活性氧的反應、氧化應激生物過程之中。研究表明，機體高活性分子活性氧簇ROS產(chǎn)生過多，超出了機體對氧化物的清除能力，可以引起腎小球基底膜結(jié)構(gòu)改變、腎小球毛細血管通透性增高，最終導致腎小球纖維化，使腎臟的損害更加嚴重，促進DN的發(fā)生和發(fā)展[28-30]。有報道稱，蓯蓉益腎顆?？筛纳瓢螂最i部位肌肉細胞內(nèi)線粒體的能量代謝功能，增強尿道內(nèi)括約肌的收縮力，同時對機體交感祌經(jīng)的損傷也有一定的保護作用，從而達到改善腎功能的作用[31]。

本研究基于模塊化網(wǎng)絡分析對蓯蓉益腎顆粒作用機制進行了初步的探索，通過已有研究結(jié)果也證明了其預測相關(guān)生物過程及信號通路的準確性。根據(jù)研究結(jié)果分析，其藥理機制可能是通過控制血糖濃度，影響AGEs-RAGE 、TNF、Toll樣受體等多信號通路，調(diào)節(jié)機體炎癥反應、對活性氧的反應、氧化應激反應等生物學過程而干預DN。本研究為更快、更好地理解蓯蓉益腎顆粒的作用機制提供了一條有效的途徑，為進一步實驗研究提供了理論支持，并可以從分子水平的功能模塊來說明中醫(yī)“協(xié)同”的科學內(nèi)涵。