津力達顆粒對高糖誘導的大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞凋亡的影響*

樂嶺，王永，孫慧伶，葉麗姿，朱梓依，李靜，王之旸

(1.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，武漢 430065)

據(jù)統(tǒng)計，成年男性糖尿病患者中出現(xiàn)糖尿病性勃起功能障礙(diabetic erectile dysfunction，DED)的比例高達50%～75%[1]。DED的發(fā)病機制非常復雜，各種誘因如高血糖、氧化應激損傷、低激素水平、血脂異常等誘導的陰莖海綿體平滑肌細胞凋亡(corpora cavemosum smooth muscle cells, CCSMCs)，是DED發(fā)生的重要病理生理學基礎[2-5]。

目前針對DED的治療方法有藥物治療和手術(shù)治療，但無論是現(xiàn)有的藥物治療還是手術(shù)治療，其療效都非常有限，亟需尋找新的藥物來幫助改善DED。

津力達顆粒是指南推薦的用于糖尿病及并發(fā)癥治療的中成藥，能多角度干預糖尿病及其并發(fā)癥[6-7]。筆者既往的研究發(fā)現(xiàn)，津力達顆粒能夠明顯改善高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞及人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖及凋亡[8]。發(fā)現(xiàn)津力達可通過抑制ERK1/2磷酸化改善高糖誘導的CCSMCs表型轉(zhuǎn)化[9]，但對于津力達與CCSMCs凋亡的關(guān)系尚無文獻報道，本研究通過觀察津力達對高糖誘導下SD大鼠CCSMCs凋亡的影響，探討其防治DED的可能性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 津力達顆粒由以嶺藥業(yè)股份有限公司提供(國藥準字Z20050845，批號：A1805010)；兔抗大鼠caspase-3(35/17KD)、兔抗大鼠bcl-2(26KD) 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(12789-1-AP)；兔抗大鼠 ERK1/2(42/44KD)購自 CST(4370)；兔抗大鼠p-ERK1/2(thr202/tyr204)(42/44KD)購自CST(4695)；內(nèi)參GAPDH(37KD)抗體購自杭州賢至生物有限公司(AB-P-R 001)；PD98059 購自selleck(S1177)；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物(KGA108，批號：KG061186)；流式細胞儀購自 BD Biosciences(FACSCalibur)；HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司(BA1054)；ECL底物液購自Thermo(NCI5079)；X光膠片購自柯達(XBT-1)；顯影定影試劑盒購自天津市漢中攝影材料廠(D-76，批號：20190309)；CCSMCs 原代細胞由南方醫(yī)科大學韋安陽教授惠贈。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞在含有5.5 mmol·L-1葡萄糖，10%胎牛血清，1%鏈霉素，1%青霉素和3 mmol·L-1谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每2天將細胞重新懸浮一次，當細胞生長至約90%時，用0.25%胰蛋白酶收獲細胞，并以1：2或1：3傳代。

1.2.2分組及干預 在藥物干預之前，將所有細胞與5.5 mmol·L-1葡萄糖一起孵育24 h。將上述細胞分為6組：①正糖組(NG組)： 生理濃度葡萄糖5.5 mmol·L-1；②高糖組(HG組)：葡萄糖25 mmol·L-1[21]；③高糖+ PD98059組(HG+PD組)：葡萄糖25 mmol·L-1+50 μmol·L-1PD98059；④高糖+低濃度津力達組(HG+LJLD組)：葡萄糖25 mmol·L-1+津力達50 mg·L-1；⑤高糖+中濃度津力達組(HG+MJLD組)：葡萄糖25 mmol·L-1+津力達150 mg·L-1；⑥高糖+高濃度津力達組(HG+HJLD組)：葡萄糖25 mmol·L-1+津力達300 mg·L-1。各組均干預48 h。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒，依照說明書進行檢測。取對數(shù)生長細胞，倒去培養(yǎng)液，將待測細胞以0.25%胰酶消化后離心收集，4 ℃預冷用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)將細胞潤洗2次，1 000 r·min-1，離心半徑r=24 cm，離心10 min，以PBS 100 μL重懸細胞，在細胞懸液中加入AnnexinV-FITC 5 μL，輕輕混勻后于5 ℃避光孵育15 min，加入PI染液10 μL，5 ℃避光孵育5 min，在1 h內(nèi)采用流式細胞儀分析凋亡細胞比率。左下象限(FITC-/PI-) 顯示活細胞，右下象限(FITC+/PI-) 顯示早期凋亡細胞，左上象限(FITC+/PI+)為機械損傷細胞，右上象限(FITC+/PI+) 顯示晚期凋亡及壞死細胞。

1.2.4Western blotting分析蛋白表達 取對數(shù)生長期的細胞等量均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶容積5 mL。待細胞同步化后，在各實驗組加入不同處理因素進行干預，每組設3個復瓶，培養(yǎng)24 h后，用4 ℃預冷的PBS沖洗3次，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作說明提取各組細胞總蛋白，采用細胞總蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘加入蛋白酶抑制劑)裂解并提取細胞總蛋白，Bradford 法測定蛋白濃度，每組蛋白質(zhì)樣本40 μg，在100 ℃下變性5 min，8% SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF膜)，室溫下，5%脫脂奶封閉2 h，加入GADPH、ERK1/2、caspase-3(按1：1000稀釋)，p-ERK1/2、bcl-2(按1：2000稀釋)，4 ℃ 孵育過夜，TBST 在室溫下脫色搖床上洗5次，每次5 min，加入二抗(1：50 000)室溫振搖2 h，TBST洗5次，每次5 min。GAPDH作為內(nèi)參對照。電化學發(fā)光顯影。 Alpha Imager圖像處理系統(tǒng)檢測熒光條帶并分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1津力達對高糖誘導下CCSMCs凋亡的影響 與NG組比較，HG組CCSMCs細胞早期及晚期凋亡率顯著升高(t=13.28，P<0.01；t=18.09，P<0.01)，表明高糖誘導CCSMCs發(fā)生凋亡。與HG組相比，HG+PD組細胞晚期凋亡率變化不明顯(P>0.05)，但早期凋亡率明顯降低(t=3.088，P<0.05)，說明高糖促進CCSMCs早期凋亡的作用可能與ERK1/2途徑有關(guān)。津力達干預各組細胞早期、晚期凋亡率均較HG組明顯下降，早期(t=7.554，P<0.05；t=7.111，P<0.01；t=7.029，P<0.01)；晚期(t=7.280，P<0.01；t=7.390，P<0.01；t=0.25，P<0.01)，說明津力達能有效抑制高糖誘導的CCSMCs早期和晚期凋亡。見表1、圖1。

表1 各組CCSMCs 早期和晚期凋亡率

2.2津力達對高糖誘導下CCSMCs p-ERK1/2、bcl-2、caspase-3蛋白表達的影響 HG組p-ERK1/2及活化型caspase-3較NG組顯著升高(t=13.38，P<0.01；t=10.61，P<0.01)，抗凋亡蛋白bcl-2顯著降低(t=98.307，P<0.01)；HG+PD 組 p-ERK1/2及活化型caspase-3較NG組降低(t=3.986，P<0.05；t=3.84，P<0.05)；抗凋亡蛋白bcl-2升高(t=4.255，P<0.05)。加入不同濃度津力達干預后，津力達干預各組p-ERK1/2水平均較HG組降低，HG+HJLD組p-ERK1/2 水平降低更為顯著(t=8.884，P<0.01)；津力達各組caspase-3水平較HG組有降低的趨勢，HG+HJLD組caspase-3水平降低更明顯(t=3.707，P<0.05)；津力達干預各組bcl-2水平較HG組顯著升高并隨津力達濃度增加呈遞增趨勢(t=5.235，P<0.01；t=6.048，P<0.01；t=5.373，P<0.01)，以上結(jié)果說明津力達干預升高了CCSMCs中抗凋亡蛋白bcl-2的表達水平；顯著降低了p-ERK1/2、活化型caspase-3蛋白的表達水平。見表2、圖2。

3 討論

陰莖海綿體主要由血管、神經(jīng)、CCSMCs和間質(zhì)等構(gòu)成。CCSMCs在正常人海綿體中的比例約為45%，是勃起組織的主要成分。據(jù)研究，勃起功能障礙發(fā)生及嚴重程度與陰莖海綿體組織結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，CCSMCs過度凋亡、勃起組織主要細胞成分 CCSMCs 減少及間質(zhì)細胞增生是DED陰莖組織病理變化的重要特征[10-12]。

DED是糖尿病常見并發(fā)癥之一，近年來，在對糖尿病患者進行陰莖海綿體活檢中發(fā)現(xiàn)，存在CCSMCs的過度凋亡，其機制認為可能是高血糖狀態(tài)下代謝紊亂改變凋亡調(diào)節(jié)基因的表達[2-3，12]。在眾多凋亡相關(guān)基因中bcl-2是目前最受關(guān)注的基因之一。其中既包括凋亡抑制基因如bcl-2、bcl-xl、bag等，也包括凋亡誘導基因如bax、bcl-xs、bad等，具有雙向調(diào)節(jié)細胞凋亡作用[13]。而caspase家族在誘導細胞凋亡的分子機制中也起著關(guān)鍵作用，是多條凋亡通路的匯聚點，在細胞凋亡的信號傳遞中caspase處于細胞凋亡下游，是執(zhí)行凋亡的最終途徑[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下SD大鼠CCSMCs凋亡顯著增加，促凋亡蛋白caspase-3表達顯著增多，抗凋亡蛋白bcl-2表達明顯下調(diào)。這與ALICI 等[12]和JESMIN等[15]學者認為DM可引起促凋亡因子caspase-3和bax活化，下調(diào)抗凋亡因子bcl-2的表達，導致海綿體組織凋亡的研究結(jié)果相一致。絲裂原活化蛋白激酶信號系統(tǒng)(MAPKs)是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸雙重磷酸化蛋白激酶家族，存在于大多數(shù)原核生物和所有真核生物中，在細胞生物信號轉(zhuǎn)導中起著十分重要的作用。它的途徑主要包括3個平行的激酶： 細胞外信號調(diào)節(jié)的激酶(ERK)、c-Jun氨基未端激酶(JNK)和p38激酶[16]。 MAPK信號系統(tǒng)在所有的肌肉組織中均表達，包括骨骼肌、心肌和平滑肌等。有研究證明，高糖通過激活ERK1/2途徑，在血管平滑肌細胞增殖、遷移、凋亡及表型變化中起作用[17-19]。CCSMCs是特殊的平滑肌細胞，在結(jié)構(gòu)和功能上與血管平滑肌細胞非常相似，因此筆者推測ERK1/2通路可能參與CCSMCs凋亡。為了研究該通路是否參與高糖誘導的CCSMCs凋亡，首先研究了高糖是否改變ERK1/2的激活，然后使用特異性抑制劑(PD98059)來阻斷該信號通路。結(jié)果顯示，高糖可上調(diào)ERK1/2的磷酸化，而加入ERK1/2抑制劑(PD98059)下調(diào)ERK1/2的磷酸化，有效抑制了高糖誘導的CCSMCs凋亡。

1.NG組；2.HG組；3.HG+PD組；4.HG+LJLD組；5.HG+MJLD組；6.HG+HJLD組；①與 NG 組比較，P<0.01；②與HG組比較，P<0.05；③與HG組比較，P<0.01。

糖尿病中醫(yī)稱為糖絡病，分為脾癉(肥胖型)和消癉(消瘦型)兩大類型，全程分為郁、熱、虛、損四個自然演變分期。DED為糖尿病氣陰兩虛并發(fā)癥，參照《糖尿病中醫(yī)防治標準(草案)》及《糖尿病中醫(yī)藥臨床循證實踐指南》，2型糖尿病并氣陰兩虛證時，建議加用口服津力達顆粒。

津力達顆粒是臨床常用的降糖類中成藥，由人參、黃精、蒼術(shù)、苦參等中藥組成，以益氣養(yǎng)陰、健脾助運為主要治則，旨在糾正水谷津液在輸布利用及代謝過程中的失衡，恢復脾臟傳輸水谷精微津液正常功能。已有研究[6-8]證實，津力達顆?？梢越档脱?，治療糖尿病及其血管并發(fā)癥，可明顯改善高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞及人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖及凋亡。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn)津力達顆粒上調(diào)海綿體平滑肌細胞表達α平滑肌肌動蛋白和堿性調(diào)寧蛋白，下調(diào)護骨素表達，維持細胞處于收縮型從而改善細胞功能。本研究還采用不同濃度津力達顆粒溶液對高糖狀態(tài)下CCSMCs進行干預，發(fā)現(xiàn)在津力達顆粒預處理后，caspase3蛋白表達降低，抗凋亡蛋白bcl-2表達明顯上調(diào)，CCSMCs凋亡顯著降低，表明津力達顆?？梢杂行б种聘咛钦T導的CCSMCs凋亡。

表2 各組CCSMCs p-ERK1/2、Bcl-2、caspase-3 相對蛋白水平

1.NG組；2.HG組；3.HG+PD組；4.HG+LJLD組；5.HG+MJLD組；6.HG+HJLD組；①與NG組比較，P<0.01；②與HG組比較， P<0.05；③與HG組比較， P<0.01。

同時，津力達顆粒干預后，p-ERK1/2蛋白表達顯著降低。提示p-ERK1/2可能在高糖誘導CCSMCs凋亡和津力達顆粒保護中起重要作用。

綜上所述，津力達顆粒能夠明顯改善高糖誘導的CCSMCs凋亡，該保護作用可能與津力達顆粒抑制ERK1/2的磷酸化，改變凋亡相關(guān)蛋白表達相關(guān)。這對于應用津力達顆粒治療DED提供了一定的理論基礎和新的思路。