血清維生素E結(jié)合蛋白及adropin蛋白在DN中的臨床價值

田 茜， 李寶新， 李 娜， 郭淑芹， 張瑪麗， 李 杰， 王 翯， 張云良

（1.承德醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，河北 承德 067000；2.保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 河北省光學(xué)感知技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的慢性微血管并發(fā)癥之一，其特征為蛋白尿和不可逆性腎功能衰竭，最終導(dǎo)致終末期腎病[1]。盡管微量白蛋白（microalbumin，mAlb）尿是DN早期診斷的金標準，但并不能準確地預(yù)測DN的發(fā)生風險。因此，發(fā)現(xiàn)更早預(yù)測DN及預(yù)防腎功能衰竭的血清標志物成為研究熱點[2]。DN的病情復(fù)雜多樣，發(fā)病機制尚不明確，長期血糖、血脂控制不佳及胰島素抵抗可能會導(dǎo)致DN病情加速進展[3]。維生素E結(jié)合蛋白（afamin，AFM）主要由肝臟合成，屬于白蛋白超家族，可參與炎癥免疫反應(yīng)，同時調(diào)節(jié)血脂及胰島素抵抗等代謝環(huán)節(jié)，影響血糖水平及體質(zhì)量[4]。有研究結(jié)果顯示，adropin蛋白（AD）是與代謝穩(wěn)態(tài)相關(guān)的蛋白，具有延緩血管內(nèi)皮細胞發(fā)生氧化應(yīng)激，促進脂質(zhì)代謝，提高血糖利用等作用[5-6]。AFM和AD可影響多種代謝途徑，但在DN患者中的變化及影響因素尚不明確。為此，本研究擬探討血清AFM及AD在DN患者中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年12月—2018年12月于保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者180例，其中男88例、女92例，參照1999年世界衛(wèi)生組織推薦的T2DM診斷標準[7]確診。參考世界衛(wèi)生組織推薦的DN診斷標準[8]，根據(jù)尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin to creatinine ratio，UACR）將T2DM患者分為3組：（1）正常UACR組（UACR＜30 mg/g），共60例，其中男28例、女32例，年齡（55.47±8.55）歲；（2）低UACR組（UACR為30～＜300 mg/g），共61例，其中男31例、女30例，年齡（57.39±7.48）歲；（3）高UACR組（UACR≥300 mg/g），共59例，其中男29例、女30例，年齡（59.14±7.37）歲。排除標準：（1）合并急性糖尿病并發(fā)癥；（2）合并原發(fā)性腎病；（3）合并急、慢性感染性疾??；（4）合并自身免疫系統(tǒng)性疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等；（5）心、腦血管疾病急性加重期。選取同期保定市第一中心醫(yī)院體檢健康者52名（正常對照組），其中男24名、女28名，年齡（55.46±7.17）歲。本研究獲得保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

收集所有對象的一般資料，包括性別、年齡、血壓、身高、體質(zhì)量及糖尿病病程等，計算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。采集所有對象空腹8 h后的靜脈血10 mL，分離血清。

空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒均購自北京九強生物技術(shù)股份有限公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，Alb）試劑盒均購自北京利德曼生化股份有限公司；檢測儀器為7600全自動生化分析儀（日本日立公司）。

T2DM患者清晨7點排空膀胱后，開始留取尿液至次日清晨7點的最后1次排尿，將尿液混勻后取10 mL[9]，采用BA400全自動特定蛋白分析儀（重慶博士泰生物技術(shù)有限公司）及配套試劑檢測尿mAlb及24 h尿蛋白，計算尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion，UAE）、UACR。

采用HA8180全自動糖化血紅蛋白分析儀測定糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）。采用cobas e601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）測定空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS），計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMAIR），公式為HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。

估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）的計算采用慢性腎臟疾病流行病學(xué)協(xié)作組（the Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration，CKD-EPI）公式[10]。女性：當SCr≤62 μmol/L時，eGFR=144×（SCr/62）-0.329×0.993年齡；當SCr＞62 μmol/L時，eGFR=144×（SCr/62）-1.209×0.993年齡；男性：當SCr≤80 μmol/L時，eGFR=141×（SCr/80）-0.411×0.993年齡；當SCr＞80 μmol/L時，eGFR=141×（SCr/80）-1.209×0.993年齡。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清AFM和AD水平。AFM試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，線性范圍為7.8～500.0 mg/L，批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜8%，批間CV＜10%。AD試劑盒購自上海酶聯(lián)免疫生物有限公司，線性范圍為12.5～400.0 pg/mL，批內(nèi)CV＜10%，批間CV＜15%。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。呈正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素或多因素方差分析。呈非正態(tài)分布的計量資料資料采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，2個組之間比較采用Nemenyi檢驗，多組間比較采用 Kruskal-WallisH檢驗。采用Spearman相關(guān)分析及多元逐步回歸分析血清AFM和AD水平與各項指標的關(guān)系。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估AFM和AD診斷DN的價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM各組及正常對照組之間一般資料的比較

正常UACR組、低UACR組、高UACR組及正常對照組之間年齡、性別、BMI、舒張壓差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。正常UACR組、低UACR組及高UACR組之間糖尿病病程差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低UACR組及高UACR組收縮壓高于正常UACR組及正常對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 T2DM各組及正常對照組之間血液指標的比較

與正常對照組比較，正常UACR組、低U A C R組、高U A C R組F B G、B U N、HbA1c、HOMA-IR升高（P＜0.05），TP降低（P＜0.05）。高UACR組HbA1c及HOMA-IR高于正常UACR組（P＜0.05），其他指標在T2DM各組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。正常對照組、正常UACR組、低UACR組、高UACR組AFM水平依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AD和Alb依次降低，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Alb除正常UACR組與低UACR組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）外，其他各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4組之間TC、TG、AST及eGFR差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表1 T2DM各組及正常對照組之間一般資料的比較

表2 T2DM各組及正常對照組之間血液指標的比較 ±s

表2 T2DM各組及正常對照組之間血液指標的比較 ±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與正常UACR組比較，#P＜0.05；與低UACR組比較，△P＜0.05

組別 例數(shù) FBG/（mmol/L） HbA1c/% FINS/（mU/L） HOMA-IR TC/（mmol/L）正常UACR組 60 8.91±2.81* 8.68±1.93* 10.46±3.97 4.16±2.08* 4.85±0.95低UACR組 61 9.59±3.36* 9.04±1.61* 11.15±4.03 4.82±2.62* 4.83±0.90高UACR組 59 9.87±3.47* 9.69±2.48*# 12.35±4.66*# 5.39±3.08*# 4.88±1.13正常對照組 52 5.42±0.42 4.72±0.60 9.60±2.36 2.32±0.61 4.92±0.66 F值 28.07 82.59 4.99 17.88 0.11 P值 0.00 0.00 0.00 0.00 0.95組別 TG/（mmol/L） AST/（U/L） TP/（g/L） Alb/（g/L） BUN/（mmol/L）正常UACR組 1.65±0.57 17.88±3.98 65.79±5.76* 42.73±3.75* 5.59±1.31*低UACR組 1.80±0.44 19.01±7.02 65.18±6.67* 42.06±3.91* 5.75±1.59*高UACR組 1.85±0.66 17.62±5.80 64.79±7.01* 39.79±5.04*#△ 6.30±2.31*正常對照組 1.67±0.42 19.34±5.15 68.89±5.50 49.93±6.01 4.59±1.14 F值 1.93 1.27 4.75 46.90 10.14 P值 0.13 0.29 0.00 0.00 0.00組別 SCr/（μmol/L） eGFR/[mL/（min·1.73 m2）] AFM/（mg/L） AD/（pg/mL）正常UACR組 63.03±9.79 100.92±12.37 80.51±27.00* 174.76±8.86*低UACR組 69.71±15.62# 98.78±18.71 99.55±24.67*# 158.36±12.01*#高UACR組 74.00±16.39*# 94.30±19.89 114.74±27.55*#△ 147.09±5.50*#△正常對照組 65.05±11.31 98.27±13.00 65.64±22.31 182.72±10.82 F值 7.59 1.68 39.67 157.85 P值 0.00 0.14 0.00 0.00

2.3 T2DM各組尿mAlb及UAE、UACR、24 h尿蛋白水平的比較

正常UACR組、低UACR組、高UACR組尿mAlb及UAE、UACR依次升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。高UACR組24 h尿蛋白水平高于低UACR組、正常UACR組（P＜0.05）。見表3。

2.4 血清AFM和AD水平與其他指標的相關(guān)性分析

將尿mAlb、UAE、UACR及24 h尿蛋白進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，使其呈正態(tài)分布。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，AFM與收縮壓、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR及24 h尿蛋白均呈正相關(guān)（r值分別為0.27、0.18、0.17、0.32、0.32、0.39、0.51、0.50、0.49、0.47、0.34，P＜0.05），與TP、Alb、AD均呈負相關(guān)（r值分別為-0.18、-0.32、-0.85，P＜0.05）。AD與TP及Alb均呈正相關(guān)（r值分別為0.19、0.45，P＜0.05），與收縮壓、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR、24 h尿蛋白及AFM均呈負相關(guān)（r值分別為-0.29、-0.29、-0.20、-0.46、-0.54、-0.36、-0.58、-0.72、-0.73、-0.73、-0.51、-0.85，P＜0.05）。

2.5 血清AFM及AD的影響因素

分別以AFM和AD為因變量，將Spearman相關(guān)分析中有相關(guān)性的項目作為自變量，進行多元線性回歸分析。結(jié)果顯示，血清AFM水平的影響因素為AD、HbA1c、UACR及24 h尿蛋白（β值分別為-0.90、0.11、0.16、0.11，P＜0.05），血清AD水平的影響因素為AFM、UACR及HbA1c（β值分別為-0.53、-0.45、-0.11，P＜0.05）。

表3 T2DM各組尿mAlb及UAE、UACR、24 h尿蛋白水平的比較 M（P25～P75）

2.6 血清AFM和AD診斷DN的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清AFM診斷DN的曲線下面積（area under curve，AUC）[95%（confidence interval，CI）]為0.80（0.75～0.86），最佳臨界值為87.57 mg/L，敏感性和特異性分別為78.30%和71.50%。AD診斷DN的AUC（95%CI）為0.96（0.94～0.98），最佳臨界值為171.86 pg/mL，敏感性和特異性分別為97.50%和92.00%。見圖1。

圖1 AFM和AD診斷DN的ROC曲線

3 討論

DN是導(dǎo)致慢性腎功能不全的主要原因，目前全球DN的患病率呈上升趨勢[11]。DN的自然發(fā)病過程包括腎小球高濾過、進行性Alb尿、腎小球濾過率下降以及最終的終末期腎病（endstage renal disease，ESRD）。盡管ESRD可能是DN最容易識別的結(jié)果，但大多數(shù)患者在需要腎臟替代治療前已死于并發(fā)的心血管疾病和感染[12]。因此，臨床亟需敏感的血清學(xué)標志物來盡早預(yù)測DN的發(fā)生，以改善DN患者的預(yù)后。

AFM是人類Alb基因家族的第4個成員，相對分子質(zhì)量為87 000，主要由肝臟表達，同時也在腎臟、腦、睪丸和卵巢等組織和器官中表達[13]。有研究結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)過量表達人類afamin基因后，小鼠體質(zhì)量增加，血清脂質(zhì)和葡萄糖水平升高[14]。一項有20 000名個體參與的研究結(jié)果顯示，血清AFM水平與T2DM的患病率及胰島素抵抗密切有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，T2DM各組AFM水平均升高（P＜0.05），且AFM與HOMA-IR呈正相關(guān)（r=0.51，P＜0.05），與文獻報道[15]一致。AFM可通過上調(diào)葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶和產(chǎn)物來使血糖水平升高，改變血脂分布，進而出現(xiàn)血壓升高、BMI增大等多種代謝綜合征表現(xiàn)，這些表現(xiàn)在DN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。KABURAGI等[16]的研究結(jié)果顯示，DN患者尿液AFM/Cr比值明顯高于單純T2DM患者，提示尿液AFM水平與DN的進展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，隨著UACR水平的升高，T2DM各組的AFM水平依次升高，且以高UACR組為最高，提示隨著DN病情的進展，AFM水平逐漸升高。這可能與腎臟AFM表達增加，導(dǎo)致DN病情進展及肝臟AFM表達增加，引起胰島素抵抗有關(guān)。相關(guān)性分析及多元線性回歸分析結(jié)果顯示，AFM與長期血糖控制情況、胰島素抵抗、腎臟功能及Alb合成密切相關(guān)。AFM或可通過影響血糖水平及加重尿蛋白丟失情況，進一步加重DN患者的病情。因此，AFM可間接反映DN病情的嚴重程度。

AD是Enho基因編碼的，由76個氨基酸組成的肽類激素，主要在肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達[17]。AD是一種調(diào)節(jié)細胞-細胞通訊的膜結(jié)合蛋白，同時可存在于各種組織和體液中。AD參與了碳水化合物及脂質(zhì)調(diào)節(jié)、能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，與胰島素抵抗、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能及內(nèi)皮細胞功能密切相關(guān)[18]。有研究結(jié)果顯示，T2DM患者血清AD水平下降，可能與AD抑制體質(zhì)量增加、增加胰島素敏感性、影響糖代謝和脂代謝有關(guān)[19]。動物實驗結(jié)果顯示，用AD治療可以降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2DM大鼠模型的血糖水平并改善胰島素抵抗[20]。本研究結(jié)果顯示，正常UACR組AD水平低于正常對照組（P＜0.05），且高UACR組高于低UACR組和正常UACR組，說明DN與AD密切相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AD與收縮壓、BUN、SCr、FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、mAlb、UAE、UACR、24 h尿蛋白均呈負相關(guān)（r值分別為-0.29、-0.29、-0.20、-0.46、-0.54、-0.36、-0.58、-0.72、-0.73、-0.73、-0.51，P＜0.05），提示AD可能通過調(diào)節(jié)患者血糖控制水平、胰島素水平及胰島素敏感性等方面來抑制糖尿病的發(fā)展，進而延緩糖尿病相關(guān)代謝變化導(dǎo)致的腎功能損傷。多元線性回歸分析結(jié)果顯示，影響AD表達的因素為AFM、UACR及HbA1c，提示DN患者隨著UACR水平的升高，AD逐漸降低，且與DN病變的嚴重程度相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，AFM及AD對DN的診斷均有一定的價值。

綜上所述，在DN患者中，隨著UACR水平的升高，AFM水平逐漸升高，AD水平逐漸下降，AFM和AD對DN均有一定的診斷價值。由于本研究的樣本量較小，相關(guān)結(jié)論需擴大樣本量進一步驗證，具體機制也需進一步研究。