采用葡萄糖參考方法為室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本確定靶值的應(yīng)用初探

金中淦， 居 漪， 張素潔， 李 卿， 歐元祝， 虞嘯炫， 孫賀偉， 范霄宇， 虞科穎

（1. 上海市臨床檢驗(yàn)中心參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室，上海 200126；2.上海市臨床檢驗(yàn)中心臨床生化免疫學(xué)研究室，上海 200126）

葡萄糖（glucose，Glu）是臨床實(shí)驗(yàn)中重要的檢測(cè)項(xiàng)目，血糖監(jiān)測(cè)是糖尿病診斷和治療的重要環(huán)節(jié)，其結(jié)果有助于評(píng)估糖尿病患者血糖代謝情況，可幫助臨床制定治療方案，并監(jiān)測(cè)療效。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室Glu檢測(cè)質(zhì)量在糖尿病管理中具有重要作用[1-2]。能力比對(duì)檢驗(yàn)（proficiency testing，PT）/室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（external quality assessment，EQA）活動(dòng)是目前管理和提高臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量的常用方式，通常依據(jù)方法學(xué)或檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，靶值為組內(nèi)均值或中位值[3]。本研究擬運(yùn)用國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）公布的同位素稀釋氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（isotope dilution gas chromatography tandem mass spectrometry，IDGC/MS）Glu參考方法[4]確定EQA樣本靶值，探索其在EQA中的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集參加上海市臨床檢驗(yàn)中心2018年第2次常規(guī)化學(xué)EQA活動(dòng)的509家各級(jí)、各類醫(yī)院的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室及獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室反饋結(jié)果。

1.2 樣品

正確度物質(zhì)為美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 965b（-70℃保存）及國(guó)際臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）提供的RELA-A和RELA-B。EQA樣品為2018年第2次EQA活動(dòng)的5份樣本，編號(hào)分別為EQA1、EQA2、EQA3、EQA4和EQA5，均為凍干血清，依據(jù)中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）-GL03-2006《能力驗(yàn)證計(jì)劃樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》評(píng)估樣品的均一性和穩(wěn)定性[5]。

1.3 儀器與試劑

Glu標(biāo)準(zhǔn)品SRM 917c，純度為（99.7±0.3）%，購(gòu)自NIST；13C6-D-Glu標(biāo)記物同位素豐度為99%，購(gòu)自美國(guó)Cambridge Isotope laboratories公司；乙腈（質(zhì)譜級(jí)）、乙酸（質(zhì)譜級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Fisher公司，乙酸酐購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。Agilent G7000B氣相質(zhì)譜儀、HP-5MS UI毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）均購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，梅特勒-托勒多分析天平（Max=220 g，d=0.1 mg）購(gòu)自德國(guó)METTLER公司，氮?dú)鈨x購(gòu)自美國(guó)THERMO公司。

1.4 參考方法賦值

上海市臨床檢驗(yàn)中心參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室是通過CNAS ISO/IEC17025/15195認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室，被認(rèn)可的項(xiàng)目包括血清Glu。賦值過程：（1）樣品前處理，在血清樣品中加入適量Glu標(biāo)記物溶液，使血清中Glu的含量與Glu標(biāo)記物含量之比約為1，加入適量無水乙醇去除蛋白質(zhì)，10 000×g離心10 min，收集上清液至另一管中；（2）衍生化反應(yīng)，取收集的上清液200 μL至另一樣品瓶中，60 ℃氮?dú)獯蹈珊?，加入鹽酸羥氨吡啶溶液（0.6 mol/L）200 μL，混勻，90 ℃條件下反應(yīng)1.5 h，冷卻后加乙酸酐300 μL，90 ℃條件下反應(yīng)1 h，60 ℃氮?dú)獯蹈?，?00 μL二氯甲烷復(fù)溶，進(jìn)行ID-GC/MS分析；（3）ID-GC/MS條件，以分流模式進(jìn)樣，分樣流比為20∶l。進(jìn)樣口溫度設(shè)定為270 ℃，氦氣流速為1.0 mL/min，初始爐溫為150 ℃，持續(xù)1 min，再以30 ℃/min的速率升至180 ℃，持續(xù)1 min，再以20 ℃/min的速率升至280 ℃，持續(xù)1 min。離子源溫度250 ℃，電離能為70 eV。選擇離子監(jiān)測(cè)模式下采集質(zhì)荷比（m/z）314和319，掃描時(shí)間為200 ms。進(jìn)樣量為1 μL；（4）測(cè)定過程，參考方法賦值過程依據(jù)本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜法樣品賦值標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，分3批次測(cè)定，每批次每個(gè)濃度樣品重復(fù)前處理3份樣本，每份樣本與標(biāo)樣同步測(cè)定，按低標(biāo)-樣品（含質(zhì)控）-高標(biāo)的次序進(jìn)樣，每份樣本最少重復(fù)測(cè)定3次，要求3次進(jìn)樣檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜2%，否則需要再增加進(jìn)樣次數(shù)至滿足要求，以3次進(jìn)樣的均值作為每份樣本的有效實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 臨床實(shí)驗(yàn)室EQA過程

樣本通過上海市臨床檢驗(yàn)中心指定冷鏈系統(tǒng)運(yùn)送到參評(píng)實(shí)驗(yàn)室，各參評(píng)實(shí)驗(yàn)室按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程測(cè)量樣本，記錄測(cè)量結(jié)果，并通過網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)上傳測(cè)定結(jié)果、所用儀器、方法等相關(guān)信息。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用上海市臨床檢驗(yàn)中心EQA評(píng)價(jià)管理平臺(tái)及Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，計(jì)算中位數(shù)及偏移。

2 結(jié)果

2.1 參考方法性能

Glu參考方法測(cè)量不精密度≤2.0%，測(cè)量參考物質(zhì)相對(duì)偏移＜1.0%。本實(shí)驗(yàn)室參加IFCC參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)比對(duì)，測(cè)定結(jié)果均在規(guī)定的等效限內(nèi)。見表1。

表1 參考方法主要性能評(píng)價(jià)

2.2 EQA樣本賦值結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中同步測(cè)定正確度物質(zhì)，要求正確度物質(zhì)測(cè)定結(jié)果在靶值允許偏移范圍內(nèi)，否則該批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。參考方法為EQA樣本定值結(jié)果。見表2。

表2 參考方法測(cè)定血清Glu結(jié)果

2.3 EQA結(jié)果分析

2.3.1 按照Glu檢測(cè)的不同方法對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析 按照Glu檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，不同方法測(cè)定的Glu水平中位值與參考方法定值結(jié)果的相對(duì)偏移為-2.22%～4.51%，見圖1。按WS/T 403-2012[6]中偏移2%的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，其中己糖激酶法5個(gè)濃度的測(cè)定值與參考方法確定靶值的相對(duì)偏移均＜2%。

圖1 不同方法測(cè)定的Glu濃度與參考方法確定靶值的相對(duì)偏移

2.3.2 按照不同檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析 不同常規(guī)分析系統(tǒng)測(cè)定的血清Glu濃度中位數(shù)與參考方法確定靶值的相對(duì)偏移見圖2。13個(gè)系統(tǒng)檢測(cè)EQA1～5結(jié)果中位數(shù)與參考方法確定靶值的相對(duì)偏移分別為-1.71%～3.47%、-0.17%～3.75%、-2.3%～3.60%、0.50%～7.52%、-1.70%～3.23%。按WS/T 403-2012[6]中偏移2%的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，只有7.69%（1/13）的常規(guī)分析系統(tǒng)測(cè)定的5個(gè)Glu結(jié)果與參考方法定值的相對(duì)偏移＜2%，有61.54%（8/13）的系統(tǒng)只有1個(gè)結(jié)果與參考方法定值的相對(duì)偏移＞2%，有15.38%（2/13）的系統(tǒng)2個(gè)結(jié)果與參考方法定值的相對(duì)偏移均＞2%，有7.69%（1/13）的系統(tǒng)3個(gè)結(jié)果與參考方法定值的相對(duì)偏移＞2%，有7.69%（1/13）的系統(tǒng)測(cè)定的5個(gè)Glu濃度與參考方法定值的相對(duì)偏移＞2%。

圖2 不同常規(guī)分析系統(tǒng)測(cè)定的血清Glu濃度與參考方法賦值結(jié)果的相對(duì)偏移

2.3.3 EQA結(jié)果分析 分別以實(shí)驗(yàn)室所有數(shù)據(jù)中位數(shù)、參考方法定值為靶值，并且以WS/T 403-2012[6]中允許總誤差的7%評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室合格率，結(jié)果見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)室合格率

3 討論

EQA中靶值的正確性、客觀性一直是質(zhì)量評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)努力的方向。本研究主要利用Glu參考方法確定EQA樣本靶值，初步探討其在上海地區(qū)EQA工作中的可行性。

本實(shí)驗(yàn)室Glu參考方法已通過2018年CNAS ISO/IEC17025/15195認(rèn)可[7]，并于2019年通過JCTLM評(píng)審認(rèn)可，該項(xiàng)目的檢測(cè)能力已獲得國(guó)際組織認(rèn)可，可以為全球提供賦值服務(wù)，保證了本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)靶值的可靠性。我們所分析的上海地區(qū)509家臨床實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，不同檢測(cè)原理測(cè)定的Glu濃度中位數(shù)與參考方法確定靶值的相對(duì)偏移為-2.22%～4.51%，己糖激酶法5個(gè)濃度的測(cè)定值與參考方法確定靶值的相對(duì)偏移均＜2%，顯示出較好的正確性。己糖激酶法的特異性高于葡萄糖氧化酶法，是公認(rèn)的血糖測(cè)定的參考方法，己糖激酶法常規(guī)分析方法原理與參考方法類似，因此其測(cè)定準(zhǔn)確性是比較高的。

按照檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分組分析，大部分系統(tǒng)測(cè)定的Glu濃度與參考方法賦值結(jié)果的相對(duì)偏移與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中2%偏移的要求還存在一定距離，但大部分系統(tǒng)是能夠滿足1/2允許總誤差的要求。張傳寶等[8]用參考方法對(duì)血清進(jìn)行賦值，并用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 965a對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，評(píng)價(jià)了13種Glu常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)的正確性，校準(zhǔn)前大部分系統(tǒng)為正偏移，與我們的研究結(jié)果一致，常規(guī)方法測(cè)定Glu的特異性問題可能是主要原因。另外，目前大部分體外診斷試劑均采用的是單一校準(zhǔn)品，該校準(zhǔn)品的濃度和定值準(zhǔn)確性是臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的重要保證。

以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中允許總誤差7%來評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室合格率，當(dāng)靶值為所有實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的中位數(shù)時(shí)，EQA1～5不合格率分別為2.16%、2.95%、3.34%、3.14 %、1.77%；當(dāng)靶值為參考方法賦值結(jié)果評(píng)價(jià)時(shí)，EQA1～5不合格率分別為2.75%、3.14%、2.75%、7.86%、2.16%。提示不同的靶值對(duì)實(shí)驗(yàn)室來講，可能會(huì)導(dǎo)致不同的質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果。CNAS-GL002：2018《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[9]指出，在能力驗(yàn)證中指定值的確定方式有多種，除去采用已知值和有證參考值外，參考方法賦值比采用參加者公議值為指定值等級(jí)高，不確定度要小[9]，可以適當(dāng)減少均值或中位數(shù)的偏移導(dǎo)致靶值出現(xiàn)偏差的情況，提高靶值和質(zhì)量評(píng)價(jià)的客觀性。EQA的關(guān)鍵是掌握樣本的互換性及靶值的設(shè)定過程，本研究主要探討靶值的設(shè)定過程，對(duì)于樣本的互換性，需進(jìn)一步探討。值得注意的是，EQA樣品雖為人血清基質(zhì)，但為了滿足保存和運(yùn)輸?shù)囊?，可能?huì)添加一定的穩(wěn)定劑，因此對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EQA4樣本出現(xiàn)的較大偏差是來自于系統(tǒng)的正確性問題還是樣本存在的互通性問題，仍需進(jìn)一步研究。EQA4樣本濃度在4 mmol/L左右，為較低水平的濃度，而本實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的參考測(cè)量范圍是1.8～26.3 mmol/L，校準(zhǔn)和測(cè)量能力為1.4%，故參考方法定值的準(zhǔn)確性比較高。對(duì)于低濃度Glu的準(zhǔn)確測(cè)量是值得被關(guān)注的。當(dāng)血糖濃度為3.4～3.9 mmol/L時(shí)，約有29.92%糖尿病住院患者易發(fā)生有癥狀低血糖；而當(dāng)血糖值為2.8～3.3 mmol/L時(shí)，約31.80%糖尿病住院患者易發(fā)生無癥狀低血糖[10]。低血糖的危害主要是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，因此應(yīng)及時(shí)檢測(cè)血糖，提高低血糖的診斷準(zhǔn)確率，以達(dá)到早期預(yù)防、及時(shí)干預(yù)的目的，減少低血糖的臨床危害[2]。后續(xù)我們將著手2方面的工作：一是嘗試開展正確度驗(yàn)證工作，使用新鮮冰凍血清考察臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平；二是研究EQA樣本的互換性，因常規(guī)EQA樣本在保存、運(yùn)輸及成本上相對(duì)正確度樣本具有較大優(yōu)勢(shì)，因此有必要評(píng)價(jià)選擇質(zhì)量較高的EQA樣本，并且制定合理的EQA評(píng)價(jià)方案，為提高臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量發(fā)揮作用。目前較高質(zhì)量EQA樣本的獲得需要實(shí)驗(yàn)室、質(zhì)量評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)及體外診斷試劑企業(yè)的共同努力[11]。

綜上所述，如何確立靶值在臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理中有重要意義。參考方法可在推動(dòng)臨床實(shí)驗(yàn)室量值溯源工作、提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量中起一定作用。質(zhì)量監(jiān)管機(jī)構(gòu)應(yīng)關(guān)注EQA樣本的質(zhì)量，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)關(guān)注低濃度Glu測(cè)量的可靠性。