恒溫擴增實時熒光檢測快速診斷結(jié)核性腦膜炎的臨床價值

歐維正， 秦 萬， 王 瓊， 王明棟， 張 娟， 徐 勇， 張廷梅

（貴陽市公共衛(wèi)生救治中心，貴州 貴陽 550003）

結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的最嚴重的肺外結(jié)核病，占所有肺外結(jié)核病的5%～10%[1]，發(fā)病率高，病死率可達15%～30%[2]。目前，診斷TBM主要依據(jù)臨床癥狀和腦脊液檢測，其中病原學(xué)檢測是診斷的金標(biāo)準。腦脊液樣本中MTB載量低，導(dǎo)致抗酸染色法敏感性差，且不能區(qū)分MTB和非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculous Mycobacterium，NTM）；培養(yǎng)法雖然結(jié)果精確、可靠，但培養(yǎng)周期為6～8周，易延誤治療。MTB核酸檢測技術(shù)分為2類：一類是以RNA擴增為基礎(chǔ)、以DNA為檢測靶標(biāo)的核酸檢測技術(shù)，如熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），目前國內(nèi)外商品化的MTB核酸檢測試劑多基于此類技術(shù)；一類是以RNA擴增為基礎(chǔ)、以為檢測靶標(biāo)的核酸檢測技術(shù)，如恒溫擴增實時熒光檢測（simultaneous amplification and testing，SAT）。MTB核酸檢測技術(shù)敏感性高、速度快，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床。本研究通過比較培養(yǎng)法、PCR和SAT檢測腦脊液樣本中MTB的效能，評價SAT在TBM診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2017年6月—2018年9月貴陽市公共衛(wèi)生救治中心疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者496例，其中328例最終臨床診斷為TBM（TBM組）[男197例、女131例，年齡（33.5±18.7）歲]；另外168例經(jīng)臨床鑒別診斷排除TBM（對照組）[男100例、女68例，年齡（40.8±20.5）歲]。

1.2 主要儀器和試劑

ABI 7300實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、Extractor 36核酸快速提取儀（北京博奧生物有限公司）、TL988實時熒光定量PCR儀（西安天隆科技有限公司）、FZP-1核酸提純儀（上海仁度生物科技有限公司）、K30干式恒溫器（上海之信儀器有限公司）等；羅氏固體培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸（p-Nitrobenzoic acid，PNB）培養(yǎng)基（珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司）、分枝桿菌核酸檢測（PCR-熒光探針法）試劑盒（北京博奧生物有限公司）、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測（RNA恒溫擴增法）試劑盒（上海仁度生物科技有限公司）。

1.3 方法

采集所有患者腦脊液樣本約6 mL，分2管送檢，1管（約2 mL）用于細菌培養(yǎng)，1管（約4 mL）用于PCR和SAT。

1.3.1 細菌培養(yǎng) 將腦脊液樣本直接接種于羅氏固體培養(yǎng)基上，若滿8周仍無細菌生長，即報告培養(yǎng)陰性。分離到的菌株參照文獻[3]進行PNB試驗，如菌株在PNB培養(yǎng)基上生長，則鑒定為NTM，反之鑒定為MTB。

1.3.2 PCR 將約2 mL腦脊液樣本按工作手冊[4]進行PCR。樣本MTB擴增曲線呈S型，且循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）＜36判定為MTB-DNA陽性；樣本NTM擴增曲線呈S型，且Ct值＜40判定為NTM-DNA陽性；MTB-DNA和NTM-DNA均為陽性時，判為MTB-DNA陽性；MTB-DNA和NTM-DNA均為陰性時，判為無分枝桿菌檢出。以試劑盒自帶的陰性、陽性對照作為質(zhì)控。

1.3.3 SAT 將約1.5 mL腦脊液樣本加入1.5 mL離心管中，14 170×g離心5 min，棄上清；加入50 μL MTB-RNA稀釋液，充分震蕩后懸浮，制成待測樣本。將待測樣本和50 μL陰性對照放入FZP-1核酸提純儀內(nèi)（液體要浸在水面以下），超聲處理15 min后取出，再14 170×g離心5 min，上清即為提取的RNA。取2 μL提取好的RNA加入含30 μL擴增檢測液的潔凈微量反應(yīng)管中，于K30干式恒溫器內(nèi)60 ℃放置10 min，再42 ℃放置5 min，之后保持在42 ℃，加入10 μL SAT酶；采用TL988實時熒光定量PCR儀進行擴增（42 ℃ 1 min，40個循環(huán)，每分鐘采1次熒光，選取FAM通道）。結(jié)果判斷：Ct值＜40判定為MTB-RNA陽性，Ct值≥40判定為MTBRNA陰性。以試劑盒自帶的陰、陽性對照作為質(zhì)控。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBM組和對照組3種方法檢測結(jié)果

496例腦脊液樣本中，培養(yǎng)法分離到37株（7.46%）菌株，經(jīng)PNB試驗鑒定均為MTB。PCR檢測檢出MTB-DNA陽性22例（4.44%），SAT檢出MTB-RNA陽性51例（10.28%）。見表1。

表1 TBM組與對照組3種方法檢測結(jié)果 例

2.2 以臨床診斷TBM為金標(biāo)準，TBM組和對照組3種方法MTB檢測效能比較

SAT檢測MTB的敏感性最高（15.24%），與培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.24，P＞0.05）；與RCR比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.23，P＜0.05）。培養(yǎng)法和PCR檢測MTB的特異性均為100%，但與SAT（特異性為99.40%）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.00，P＞0.05）。見表2。

表2 3種方法MTB檢測效能

2.3 以培養(yǎng)法為標(biāo)準，TBM組3種方法MTB檢測結(jié)果比較

T B M組3 2 8例腦脊液樣本中，7 7例（23.48%）檢測到MTB。以培養(yǎng)法為標(biāo)準，SAT的符合率為82.01%，敏感性為37.84%，特異性為87.6%。PCR的符合率為86.89%、敏感性為21.62%、特異性為95.19%。見表3。

表3 TBM組3種方法MTB檢測結(jié)果比較

3 討論

TBM屬于重癥結(jié)核病，是結(jié)核病患者死亡的主要原因之一。對TBM患者進行早期診斷、規(guī)范治療，可顯著降低其致殘率、致死率[5]。由于TBM患者病情輕重程度不同、就診階段不同、臨床表現(xiàn)多樣，加之腦脊液實驗室檢查特征性結(jié)果較少，導(dǎo)致確診TBM的難度較大，但檢出腦脊液樣本中的MTB仍然是確診TBM的金標(biāo)準。

SAT方法是基于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴增（transcription mediated amplification，TMA）和恒溫擴增技術(shù)發(fā)展起來的一項新的核酸檢測技術(shù)，其原理是通過設(shè)計特異性的MTB核糖體RNA擴增引物及優(yōu)化探針技術(shù)，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及極高轉(zhuǎn)錄活性的T7 RNA多聚酶同時實現(xiàn)核酸恒溫擴增和實時熒光檢測，能夠快速、直觀地反映樣本中有無MTB。與傳統(tǒng)的基于DNA模板的核酸擴增技術(shù)相比，其優(yōu)點為[6]：（1）對儀器的要求低，操作簡便，穩(wěn)定性和結(jié)果準確性高；（2）起始靶標(biāo)為環(huán)境中極易降解的RNA，可有效避免污染；（3）因RNA只在活菌中存在，SAT還可監(jiān)測疾病活動性及藥物療效；（4）RNA拷貝數(shù)比DNA的拷貝數(shù)高，并且熒光標(biāo)記的RNA探針可同步檢測擴增信號，提高檢測敏感性。

本研究采用培養(yǎng)法、PCR和SAT對腦脊液樣本進行同步檢測，比較3種方法檢測結(jié)果，以評估SAT快速檢測腦脊液樣本中MTB的效能，結(jié)果顯示，以臨床診斷TBM作為標(biāo)準，SAT檢測MTB的敏感性為15.24%，與培養(yǎng)法（11.28%）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與PCR（6.71%）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與張海晴等[7]的研究結(jié)果一致。目前，關(guān)于SAT檢測腦脊液樣本的研究較少，而對其檢測痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液等樣本的研究[8-9]較多，結(jié)果均顯示SAT對這些樣本中的MTB有較高的檢測敏感性，并優(yōu)于培養(yǎng)法。本研究采用的3種方法在操作上均無需對腦脊液樣本進行前處理，保證了3種方法檢測前樣本的一致性，增加了檢測結(jié)果的可比性。但因腦脊液載菌量低、取樣量少，抗結(jié)核藥物治療后腦脊液細菌負荷量迅速下降[10]等因素，往往導(dǎo)致MTB檢測敏感性不高。2009年，英國感染學(xué)會建議TBM患者在抗結(jié)核藥物治療前留取不少于6 mL的腦脊液進行細菌學(xué)檢查，并且在檢測前將腦脊液樣本3 000×g離心至少20 min[11]。

本研究結(jié)果顯示，SAT檢測MTB的特異性為99.40%，略低于培養(yǎng)法和PCR（100%），但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。SAT和PCR同屬于分子生物學(xué)檢測方法，控制實驗室污染是檢測成功的關(guān)鍵。2000年，BARAN等[12]指出，SAT雖然具有一定的檢測效率，但仍然存在一定的假陽性率與假陰性率。盡管SAT檢測的RNA易降解，但操作不當(dāng)仍然可能會造成污染。本研究SAT檢測出現(xiàn)1例假陽性，提示該技術(shù)在操作過程中應(yīng)嚴格遵守各項規(guī)范，避免人為因素降低其檢測效能。

本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)法MTB陽性檢出率與SAT差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與PCR差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SAT對腦脊液MTB的檢測效果更接近培養(yǎng)法，優(yōu)于PCR和SAT，有明顯的快檢優(yōu)勢。

RNA降解快，如果患者的腦脊液含菌量不多，而SAT操作時間控制不當(dāng)，如放在核酸提純儀中超聲處理留置時間過長，也可能會造成SAT對MTB的檢出率下降[13]；另外，若樣本中或容器內(nèi)存在核酸擴增抑制劑，檢測出現(xiàn)假陰性的可能性會增加[14]。這些均可能導(dǎo)致部分結(jié)果培養(yǎng)法為陽性，而SAT檢測陰性。

本研究結(jié)果表明，3種方法腦脊液MTB陽性總檢出率為23.48%，優(yōu)于單一使用任一方法。目前，尚無一種可快速、準確地診斷結(jié)核病的方法，采用SAT、PCR等快速分子診斷技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，不僅可以提高診斷率，還可以縮短診斷周期，為臨床對結(jié)核病的診治提供更準確、更快速的依據(jù)。

綜上所述，SAT能快速檢測腦脊液中的MTB，敏感性較高，可用于對TBM患者進行早期診斷。3種方法聯(lián)合檢測可提高腦脊液MTB的陽性檢出率。