脂質(zhì)組學分析中樣品前處理技術(shù)的研究進展

宋詩瑤, 白 玉, 劉虎威

(北京分子科學國家實驗室, 北京大學化學與分子工程學院, 北京 100871)

作為代謝物的一大類重要組成部分,脂質(zhì)在生命體中扮演著重要作用,如磷脂雙分子層是構(gòu)成細胞膜的基本骨架,可維持細胞的完整性和相對獨立性;脂肪酸和甘油三酯是多種細胞的能量來源,維持細胞的基本活動與功能;許多脂質(zhì)分子如類花生酸、溶血磷脂、內(nèi)源性大麻素等可作為二級信號傳遞分子,參與細胞信號傳導等。脂質(zhì)組學(lipidomics)作為代謝組學(metabolomics)的一個重要分支,是對脂質(zhì)及其相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能進行研究的科學,其定義為“對脂質(zhì)分子種屬及其在生物學上的作用,涵蓋脂類代謝、功能蛋白質(zhì)表達以及基因調(diào)控等因素的全面描述”[1]。根據(jù)脂質(zhì)化學結(jié)構(gòu)的差異,可將其分為8大類[2]:脂肪酰類(fatty acyls, FA)、甘油酯類(glycerolipids, GL)、甘油磷脂類(glycerophospholipids, GP)、鞘脂類(sphingolipids, SP)、固醇類(sterol lipids, ST)、異戊烯醇類(prenol lipids, PL)、糖脂類(saccharolipids, SL)和聚酮類(polyketides, PK)等。每一類型的脂質(zhì)由于極性頭基、碳鏈長度或不飽和度的差異又可形成不同的結(jié)構(gòu),由此組成種類繁多、性質(zhì)各異的脂質(zhì)分子。越來越多的研究表明,脂質(zhì)的合成或代謝異常與多種疾病密切相關(guān),如癌癥[3]、阿茲海默癥[4]、動脈粥樣硬化[5]等。脂質(zhì)組學研究已成為生命科學研究領(lǐng)域的熱點,面對復雜的脂質(zhì)組分,發(fā)展準確、靈敏、可靠的脂質(zhì)組學分析方法顯得尤為重要。

目前,質(zhì)譜(MS)已成為脂質(zhì)組學研究中最有效的技術(shù)手段之一。基于MS的分析方法主要可分為3種:利用MS直接進樣檢測的“鳥槍法”,與其他分離技術(shù)如液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、毛細管電泳(CE)等結(jié)合的聯(lián)用方法,以及可實現(xiàn)樣品空間分布的質(zhì)譜成像(MSI)方法。脂質(zhì)組學研究對象通常是基質(zhì)復雜的生物樣品,如血清、血漿、尿液、組織等,除MSI方法外,在進行分析前往往需要對樣品進行富集和提取。提取后的脂質(zhì)在MS檢測時可能仍會面臨靈敏度低等問題,這就需要對樣品做進一步處理,化學衍生化是解決該類問題的有效手段之一。本文針對脂質(zhì)組學分析中的樣品前處理技術(shù),以脂質(zhì)化合物提取方法與衍生化技術(shù)為重點進行了評述,并對其發(fā)展趨勢進行了展望。

1 脂質(zhì)的提取與富集技術(shù)

通常生物樣本采集后直接利用液氮快速冷凍,之后放入低溫(如-80 ℃)環(huán)境儲存,從而盡量減少樣品中各類物質(zhì)發(fā)生改變[6]。在進行分析前,液體樣品在4 ℃條件下復溶,然后進行充分混合;固體樣品則可借助研缽或勻漿機,通過加入適當溶劑完成混合[7]。

常用的脂質(zhì)提取技術(shù)主要包括液液萃取(LLE)與固相萃取(SPE)兩種方式。由于LLE可提取出較為全面的脂質(zhì)分子,適用于非靶向全脂分析;SPE過程使樣品經(jīng)過分離和富集步驟,進一步除去干擾物質(zhì),提高被分析物的濃度,更適用于某一類或某幾類脂質(zhì)分子的靶向代謝組學分析。

1.1 液液萃取

生物樣品中蛋白質(zhì)的存在會影響脂質(zhì)分析方法的精確度與準確性,如不提前去除,可能縮短儀器的使用壽命[8]。為了減少樣品損失,前處理步驟應(yīng)盡可能少,相對簡單的操作是將蛋白質(zhì)沉淀與脂質(zhì)提取一步完成。Zhao等[9]提出一種向血樣(血清或血漿)中加入過量甲醇的簡單提取方法,用來分析人血中的磷脂和溶血磷脂。t’Kindt等[10]用同樣的方法提取了人皮膚中的神經(jīng)酰胺,其中一部分利用電噴霧電離-質(zhì)譜(ESI-MS)的負離子模式進行分析,而另一部分提取液經(jīng)SPE提取后在正離子模式條件下進行分析,兩部分結(jié)果總計鑒定到264種神經(jīng)酰胺分子。

由于復雜的脂質(zhì)分子間極性存在巨大差異,一種溶劑的提取方法已不能滿足全脂分析的需求,混合溶劑的單相提取方法得到了發(fā)展。Pellegrino等[11]開發(fā)了一種全脂分析方法,他們向50 μL血清中加入1 mL甲醇-甲基叔丁基醚(MTBE)-氯仿(1.33∶1∶1, v/v/v)混合溶液(MMC),經(jīng)過渦旋、離心后用LC-MS進行分析。結(jié)果表明,血清中9種脂質(zhì)的回收率接近100%。Calderón等[12]在Sarafian等[13]工作的基礎(chǔ)上,以宮頸癌Hela細胞為分析對象,比較了兩種單相異丙醇-水混合體系(75∶25, v/v和90∶10, v/v)與傳統(tǒng)兩相萃取體系(Bligh-Dyer法[14]和Matyash法[15])的性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),異丙醇-水(90∶10, v/v)的萃取效果與Matyash法相當,并且優(yōu)于另兩種方法。除此之外,研究人員報道了多種單相萃取體系用于脂質(zhì)組學分析,如氯仿-甲醇(2∶1, v/v)[16]、正丁醇-甲醇(1∶1, v/v)[17]體系等。Jurowski等[18]就用于脂質(zhì)組學分析的單相混合溶劑進行了綜述。

LLE是脂質(zhì)組學中使用最廣泛的萃取方法。與單相溶劑萃取體系不同,LLE利用被分析物在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的差異實現(xiàn)不同物質(zhì)的分離。脂質(zhì)組學分析中應(yīng)用最多的LLE方法有3種:Folch法[19]、Bligh-Dyer法和Matyash法。其中Folch法使用氯仿-甲醇-水(8∶4∶3, v/v/v)混合溶劑對生物樣品進行全脂提取,Bligh-Dyer法在上述方法的基礎(chǔ)上進行了改進,使用相同溶劑體系但不同體積比(2∶2∶1.8),以此減少溶劑用量,縮短提取時間,并且還可減少有毒試劑氯仿的使用。氯仿與甲醇的混合體系能在多種復雜基質(zhì)中非選擇性地提取出各種脂質(zhì)分子,水相的加入可以增強相分離,減小脂質(zhì)在水相中的溶解度,從而提高萃取效率。為了減小溶劑毒性,Carlson[20]用二氯甲烷替代氯仿進行血清和組織的脂質(zhì)萃取。然而,上述方法在進行脂質(zhì)提取時,含有脂質(zhì)的有機相位于兩相溶液的下層,無論是直接移取下層溶液還是去除上層液體,都面臨可能造成溶液污染或樣品損失的問題。

Matyash等[15]使用低密度的MTBE與甲醇和水組成的混合溶液(10∶3∶2.5, v/v/v)作為萃取溶劑對鼠腦和人血漿進行全脂分析,并與Folch法和Bligh-Dyer法進行對比。結(jié)果表明,在4種不同的基質(zhì)中,Matyash法的回收率與其他兩種方法的結(jié)果相當甚至更好。使用MTBE代替氯仿,降低了溶劑的毒性和致癌性,并且含脂質(zhì)的有機相位于兩相溶液的上層,簡化了相分離步驟。L?fgren等[21]提出了另一種基于丁醇和甲醇的無氯仿體系(BUME),他們向75 μL血漿中加入300 μL丁醇-甲醇(3∶1, v/v)溶液后,再加入300 μL庚烷-乙酸乙酯(3∶1, v/v)溶液和300 μL 1%(v/v)乙酸水溶液進行全脂萃取。整個萃取過程在96孔板中進行,在60 min內(nèi)即可實現(xiàn)96份樣品的提取。該方法分析速度快,自動化程度高。

近幾年來,基于LLE方法的脂質(zhì)組學在多個領(lǐng)域開展應(yīng)用,所用的萃取體系多是在上述傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上進行改進。Buyer等[22]在Bligh-Dyer溶劑的基礎(chǔ)上加入了0.25 mol/L碳酸氫銨,以萃取分析土壤中的磷脂脂肪酸(PLFA),這種揮發(fā)性鹽的加入不僅使PLFA的萃取效率提高,也提高了土壤中其他代謝物的提取效率。Sostare等[23]則通過改變Matyash溶劑的體積比(MTBE-甲醇-水的體積比由10∶3∶2.5改為2.6∶2.0∶2.4)提高分析方法的萃取效率和重現(xiàn)性。Ren等[24]利用4種方法提取微藻樣品中的脂質(zhì)時,在每種方法的兩步提取過程間增加一步純水相提取步驟。結(jié)果表明,增加水相處理步驟后脂質(zhì)萃取效率大大提高,提取的脂質(zhì)中甘油三酯的比例有所提高,這在生物柴油的生產(chǎn)領(lǐng)域非常有用。Ulmer等[25]考慮到上述3種最常用方法的萃取溶劑體積可能會隨樣品基質(zhì)的不同有所改變,他們以人血漿樣品為研究對象,對3種方法所用樣品與萃取溶劑的體積比分別進行了優(yōu)化。除此之外,不同方法對相同樣品萃取效果的比較也有諸多研究報道[11,12,26,27]。

1.2 固相萃取

SPE是利用不同物質(zhì)在固液兩相中相互作用的差異實現(xiàn)分離的,其具體操作是先使被分析物吸附到固定相上,然后使用不同洗脫能力的溶液(流動相)分步洗脫,實現(xiàn)樣品的分離、純化與富集,SPE常被用于脂質(zhì)的萃取。一般來說,SPE常用于LLE之后,目的是去除萃取液中的干擾物質(zhì)或特異性富集某一類或某幾類脂質(zhì),以用于靶向脂質(zhì)組學分析。

Hewelt-Belka等[28]先用Bligh-Dyer法對母乳進行全脂萃取,上層水相含有的極性代謝物通過親水相互作用色譜(HILIC)-MS進行分析,另一份樣品用Hybrid SPE-Phospholipid柱處理,將含有磷脂的洗脫部分與LLE的下層有機相合并后進行RPLC-MS分析。該方法可同時獲得母乳中高豐度甘油糖脂與低豐度甘油磷脂和鞘脂類的信息,是一種可對母乳進行全脂分析的半定量方法。Flieger等[29]使用Cu2+修飾的硅膠柱用于血漿樣品中磷脂的去除。在探究去除磷脂方法的方面,Warren[30]用硅膠作為固定相,氯仿、丙酮、甲醇依次進行洗脫,驗證甲醇洗脫液中是否只含有磷脂,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇洗脫下來的部分除含磷脂外,還有多種其他極性脂質(zhì)。目前已有多種商用化SPE固定相用于脂質(zhì)組學分析,常用的為硅膠基底,如C8柱或C18柱以及非鍵合或鍵合了氨基、氰基、二羥基或氨丙基的硅膠柱等[31]。硅膠柱和氨丙基柱常被用于分離中等極性和極性脂質(zhì),而C8柱和C18柱則被用于從水相樣品的極性物質(zhì)中分離腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂和脂肪酸等物質(zhì)[31]。

相對于SPE,固相微萃取(SPME)使用溶劑量少,分析速度快。SPME常使用一根帶有涂層的纖維用于萃取分析物,基于靜電作用、離子交換作用、疏水相互作用等作用力,目前使用較多的涂層有聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚苯胺(PANI)等[32]。Garwolińska等[33]將一根表面修飾PAN-C18的纖維用甲醇-水(1∶1, v/v)混合溶劑活化20 min后直接插入1 mL母乳中,經(jīng)過5 min吸附后,再放入100 μL異丙醇中進行洗脫,5 min后取出該纖維,洗脫液直接用于LC-MS分析。該方法分析速度快,操作簡便,適用于母乳的全脂分析,并且該方法通過MS的輪廓分析可以區(qū)分母乳、配方奶粉和牛奶樣品。Deng等[34]則使用一種生物相容性材料作為探針的涂層,開展原位、體內(nèi)和微尺度的脂質(zhì)組學研究。他們將表面修飾有親水性殼聚糖聚合物的鎢針直接插入斑馬魚、大型溞和單個真核細胞內(nèi)進行萃取,洗脫后用納升電噴霧電離(nanoESI)-MS進行檢測。與傳統(tǒng)的鳥槍法相比,該方法檢測到的脂質(zhì)結(jié)果相似,但樣品消耗量少,分析時間短。

SPME技術(shù)常與GC或GC-MS結(jié)合用于揮發(fā)性物質(zhì)的分析,如頂空-GC(HS-GC)的進樣針首先在一定條件下對固體、液體或氣體樣品進行萃取吸附,進而在進樣口實現(xiàn)洗脫/解吸附并完成進樣。此外,SPME也可與全二維GC(GC×GC)分析結(jié)合,借助高靈敏的質(zhì)譜檢測技術(shù)用于環(huán)境污染物和農(nóng)用化學品的檢測[35]。目前,SPME結(jié)合GC-MS已成功用于多種樣品中脂肪酸或脂肪酸酯的分析,如水果[36]、牛奶[37]、白酒[38]等。盡管SPE/SPME方法所用小柱或涂層容易達到飽和,成本較高,但具有樣品和溶劑消耗少、分析速度快、易于自動化的優(yōu)點,適用于極少量樣品、大規(guī)模樣品及原位分析。

1.3 其他萃取技術(shù)

近年來,除了LLE與SPE方法外,許多其他方法也已用于脂質(zhì)組學樣品前處理中,如微波輔助提取法(MAE)、超聲輔助提取法(UAE)、超臨界流體提取法(SFE)等。MAE主要利用微波的能量在萃取過程中提高溫度和壓力,從而加快萃取速度,提高萃取效率,并且減少有機溶劑的用量[39]。由于萃取過程中溫度的升高,MAE可能造成熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的分解。de Morais等[40]在人血漿樣品的脂質(zhì)提取中,比較了5種LLE方法與MAE法。結(jié)果顯示,MAE與Folch法的脂質(zhì)萃取總量相當,但用GC檢測到的24種脂肪酸含量前者低于后者,說明MAE適合于定性而非定量分析。Pan等[41]以一種離子液體為溶劑,用MAE與傳統(tǒng)LLE相比較,檢測結(jié)果相近但萃取速度大大提高。這都說明在利用MAE萃取脂質(zhì)時,需要根據(jù)待測物的性質(zhì)進行條件優(yōu)化,以期實現(xiàn)最佳的萃取效果。

UAE是利用超聲波產(chǎn)生的機械振動、擴散等效應(yīng)加速兩相間物質(zhì)傳遞,從而實現(xiàn)萃取的技術(shù)[42]。與MAE不同的是,UAE過程中不會升溫,有利于熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的分析。此外,UAE可與LLE相結(jié)合,進一步提高樣品中被分析物的萃取效率。Liu等[43]分析了超聲對人血清樣品的萃取及衍生過程的影響,結(jié)果表明,萃取及衍生過程均在超聲條件下進行時,測得的脂肪酸信號增加了5%～60%。

超臨界流體是指溫度與壓力均處于臨界值以上的流體,具有低密度與高擴散性的特點,適合于樣品的萃取或分離。SFE中最常用的超臨界流體是CO2,其臨界壓力(7.4 MPa)與溫度(31 ℃)均較低,并且無毒害,易于去除。超臨界CO2的極性與戊烷相近,適合于疏水性物質(zhì)的萃取。用甲醇、二氯甲烷或水作為添加劑,SFE也可用于極性物質(zhì)的萃取[44]。利用SFE的非破壞性,Deviese等[45]用反應(yīng)曲面法優(yōu)化出SFE的最佳條件,用于考古陶罐表面的脂質(zhì)分析。與傳統(tǒng)LLE相比,萃取效率得到提高,并且兩種萃取方法得到的不飽和與飽和脂肪酸的比值不同。SFE作為一種新型的萃取分離技術(shù),其萃取效率高,無污染,操作方便,適合于生物、食品、藥物等樣品的分析[46-48]。

2 脂質(zhì)的化學衍生化技術(shù)

經(jīng)過樣品提取的脂質(zhì)在檢測過程中可能面臨如下挑戰(zhàn):由于脂質(zhì)分子種類多樣,化學性質(zhì)有所差異,使得不同脂質(zhì)分子在MS檢測過程中離子化效率差異顯著;脂質(zhì)分子的動態(tài)分布范圍較寬,離子化過程中存在離子抑制效應(yīng);儀器對低濃度物質(zhì)的檢測靈敏度不足;用于定量的脂質(zhì)內(nèi)標分子不易獲得;脂質(zhì)分子存在大量同分異構(gòu)體,定性定量困難等。對脂質(zhì)樣品進行化學衍生化處理可能是解決這些問題的有效手段之一。在脂質(zhì)組學分析中選擇合適的衍生化方法,有利于實現(xiàn)離子化效率的提高,檢測靈敏度的提升,化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的增強,甚至同分異構(gòu)體的區(qū)分等。

2.1 針對脂質(zhì)雙鍵的衍生化反應(yīng)

對于脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)確證,通?；诔Ｒ?guī)的二級質(zhì)譜圖,即通過一些特征碎片得到脂質(zhì)類別、碳鏈組成及碳鏈位置信息。但是,碳鏈中不飽和雙鍵的位置信息卻難以獲得。這主要是由于常規(guī)的碰撞誘導解離(CID)方式能量較低,無法達到斷裂碳碳雙鍵所需要的能量要求。Tomer等[49]利用快原子轟擊(FAB)離子源分析脂肪酸,并對其[M-H]-離子的碰撞活性解離(CAD)質(zhì)譜圖進行分析,由于高能CAD質(zhì)譜碎片包含每個碳碳鍵的斷裂信息,其中一端含烯丙基的碎片強度最高,從而可以判斷雙鍵位置。但該方法所產(chǎn)生的碎片多,譜圖解析困難,并且不適用于含3個雙鍵以上脂質(zhì)分子的分析[50]。在質(zhì)譜分析前進行特殊的化學衍生,如烷硫基化衍生[51],可以將雙鍵轉(zhuǎn)化成特定的功能基團,后續(xù)在CID條件下進行質(zhì)譜檢測。但這些方法通常需要較大的樣品量或色譜分離步驟,分析效率較低,因此針對脂質(zhì)雙鍵的在線衍生化新方法在過去幾年得到了飛速發(fā)展。

圖 1 臭氧引入質(zhì)譜的實驗裝置圖及其對人血漿中脂質(zhì)的鑒定[58]Fig. 1 Experimental set-up diagram for ozone introduction into the mass spectrometer and identification of lipids of human plasma[58]

臭氧誘導解離(OzID)是一種可以鑒定單/多不飽和脂質(zhì)的有效方式[52,53]。OzID利用離子化的脂質(zhì)與中性的臭氧分子在質(zhì)譜內(nèi)發(fā)生氣相離子-分子反應(yīng),從而產(chǎn)生帶有雙鍵位置信息的碎片。由于儀器限制,向質(zhì)譜內(nèi)部傳輸?shù)某粞鯘舛容^低(約109～1012分子/cm3)[52,54],因此需要較長的反應(yīng)時間(～1 s)才能達到檢出信噪比要求,這就限制了OzID與快速LC的聯(lián)用。最近的研究表明,提高質(zhì)譜反應(yīng)區(qū)域內(nèi)臭氧的密度,可以顯著提高OzID的循環(huán)周期[55-57]。當臭氧分子密度達到～1015分子/cm3時,OzID的反應(yīng)時間可以減小至100 ms以下,使得OzID的循環(huán)周期與質(zhì)譜匹配,并可以結(jié)合LC的分離能力進行脂質(zhì)組學分析。Poad等[58]通過改造離子淌度-飛行時間質(zhì)譜(IMS-QTOF)的捕獲離子漏斗(見圖1),在IMS分析前發(fā)生臭氧化反應(yīng),并結(jié)合LC建立LC-OzID-IMS-MS方法,實現(xiàn)了脂質(zhì)雙鍵位置的鑒定。盡管OzID在分析混合物時有巨大的應(yīng)用前景,但該方法目前沒有專用儀器,通常需要特殊的質(zhì)譜儀器或?qū)x器進行改造,因而使其應(yīng)用受到限制。

瑕瑜課題組[59]于2014年提出基于Paternò-Büchi(PB)反應(yīng)，結(jié)合MS/MS鑒定不同類型脂質(zhì)雙鍵位置的方法(見圖2a)。PB反應(yīng)是一個典型的[2+2]光催化環(huán)加成反應(yīng),在紫外燈的照射下,被分析物與丙酮發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生的四元氧雜環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)在MS的碰撞能作用下發(fā)生裂解,得到一對分子量相差26 Da的碎片離子,進而用于確定雙鍵位置。該在線衍生方法操作簡單,反應(yīng)迅速,并且可以用于復雜樣品中脂質(zhì)雙鍵位置的分析。目前,PB反應(yīng)已經(jīng)用于FA、GP、膽固醇酯等雙鍵位置的分析中[59-61]。為了解決由于丙酮相對分子質(zhì)量較小造成譜圖中碎片難以匹配、母離子易于重疊等問題,Xu等[62]使用苯甲酮作為PB反應(yīng)的衍生化試劑。將PB反應(yīng)與基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像(MALDI-MSI)技術(shù)結(jié)合,可實現(xiàn)組織中磷脂和糖脂雙鍵位置的原位鑒定和成像(見圖2b)[63]。

圖 2 PB反應(yīng)用于脂質(zhì)異構(gòu)體的(a)雙鍵位置鑒定和(b)組織成像[59,63]Fig. 2 (a) Double bonds identification and (b) tissue images of lipid isomers applied by Paternò-Büchi (PB) reaction[59,63] a. experimental set-up of UV irradiation with a nanoESI plume and PB reaction mass spectra of oleic acid and acetone induced by UV irradiation of nanoESI[59]; b. the reaction chamber developed for on-tissue PB derivatization and the images of diagnostic ion pairs representing PC 36∶1 and PS 36∶2 db-positional isomers[63].

近幾年來利用化學反應(yīng),如臭氧化和PB反應(yīng)衍生等,在脂質(zhì)不飽和鍵位置的鑒定方面開展了一系列創(chuàng)新性的研究工作,解決了長期困擾脂質(zhì)組學研究中脂質(zhì)不飽和鍵位置鑒定困難的問題。上述反應(yīng)是較為通用的雙鍵加成反應(yīng),理論上適用于所有不飽和脂質(zhì)的分析,但由于反應(yīng)效率相對有限,在低豐度不飽和脂質(zhì)分析中仍面臨挑戰(zhàn)。

2.2 針對脂質(zhì)極性頭基的衍生化反應(yīng)

衍生化反應(yīng)通常需要根據(jù)研究目的及待測物上的活性基團,選擇合適的衍生化試劑。在此基礎(chǔ)上,為提高定量的準確性,進一步發(fā)展出了穩(wěn)定同位素標記衍生化(SILD)方法,其原理是分別用輕質(zhì)和重質(zhì)同位素標記的衍生試劑與樣品和標準品反應(yīng),按一定比例混合后進樣,根據(jù)結(jié)果中輕標和重標衍生產(chǎn)物的比值即可對相應(yīng)組分進行相對定量。與常規(guī)衍生化方法相比,SILD有利于解決樣品基質(zhì)干擾嚴重、內(nèi)標不易獲得等問題,從而提高定量準確性。

脂肪酸的測定一直是研究人員關(guān)注的熱點。GC-MS已成為應(yīng)用最廣的脂肪酸分析方法,而烷基化和酯化衍生則是GC-MS分析脂肪酸最主要的衍生方式[64]。N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰氨(MSTFA)是硅烷化衍生最常用的試劑,為了加快反應(yīng)速度,可以加入催化劑碘化銨(NH4I)或三甲基氯硅烷(TMSCl)和抗氧化劑二硫赤蘚糖醇(DTE)等物質(zhì)[65]。將MS的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)與LC相結(jié)合,可以使脂肪酸分析的靈敏度和選擇性獲得進一步提升。用于脂肪酸的羧基衍生試劑有N-甲基-2-苯乙胺(MPEA)[66]、2-二甲氨基乙基胺(DMED)[67]、4-(2-((4-溴苯乙基)二甲氨基)乙氧基)二溴苯胺(4-APEBA)[68]等。由于N-(4-芐氨基)吡啶嗡(AMPP)[69]、三甲基氨基乙基(TMAE)[70]等帶有分子內(nèi)永久電荷,衍生化后可大大提高被分析物的離子化效率,從而進一步提高方法的靈敏度。與未衍生的脂肪酸相比,AMPP衍生后方法的檢測靈敏度提高了約60 000倍[69]。Narayana等[71]發(fā)展了一種類似同位素標記相對和絕對定量分析(iTRAQ-like)的復合方法用于生物樣本中脂肪酸的分析。該方法靈敏度達到nmol/L級,可檢測到不同狀態(tài)下神經(jīng)元和神經(jīng)分泌細胞胞吐過程中脂肪酸的變化。脂肪酸羥基脂肪酸酯(FAHFA)是一類具有抗糖尿病和抗炎活性的新型內(nèi)源性脂肪酸[72],但由于其結(jié)構(gòu)相似且在生物樣品中含量較低,FAHFA的準確定量存在困難。朱泉霏等[73]用DMED對16種FAHFA進行衍生,并結(jié)合強陰離子交換(SAX)-SPE與UPLC-MS聯(lián)用的方法,使其檢測靈敏度提高了7～72倍,檢出限(LOD)達到0.01～0.14 pg。

GP是構(gòu)成細胞膜的主要成分,且具有重要的生理作用。重氮甲烷是一種常用的甲基化試劑,可與多種基團發(fā)生作用,也用于GP的衍生[74,75]。盡管重氮甲烷衍生反應(yīng)速度快、效率高,但該試劑具有刺激性、可燃、高毒且易爆的特點,使用過程中需要高度小心且反應(yīng)條件較為苛刻。Lee等[76]用三甲基硅烷基重氮甲烷(TMSD)作為衍生試劑,并結(jié)合超臨界流體色譜(SFC)-MS/MS,在6 min內(nèi)對19種極性脂質(zhì)進行分析,檢測靈敏度最高提高了4 500倍。Cai等[77]則利用TMSD的SILD方法對細胞和小鼠肝臟中6大類GP及他們對應(yīng)的溶血磷脂進行了定性和相對定量分析。用于GP的衍生試劑還有2-肼基喹啉(HQ)[78]、N,N-二甲基哌嗪基碘(DMPI)[79]等。馬會芳等[80]在綜述中介紹了近10年基于衍生化技術(shù)的GP分析方法及其應(yīng)用研究進展。

關(guān)于其他類脂質(zhì)的衍生化方法也有許多報道,如馮鈺琦課題組[81]比較了4種衍生化試劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),2-(2-肼基-2-乙酰)異喹啉溴嗡(HIQB)對羰基化合物的衍生具有最高的檢測靈敏度。該課題組也報道了基于吉拉德試劑P的SILD策略,成功分析了雄激素和孕激素類固醇[82]。趙先恩研究組[83]發(fā)展了羅丹明類似物作為衍生化試劑的方法,膽固醇類物質(zhì)的分析靈敏度獲得顯著提高。近年的有關(guān)綜述介紹了針對不同官能團的衍生化試劑的發(fā)展及其在脂質(zhì)分析中的應(yīng)用[84-86]。

3 結(jié)論與展望

綜上所述,合適的樣品前處理方法在脂質(zhì)組學研究中至關(guān)重要,它不僅決定組學數(shù)據(jù)的質(zhì)量,方法的檢測靈敏度,甚至包括方法的應(yīng)用范圍。發(fā)展樣品中全脂的提取方法是非靶向分析的關(guān)鍵;對于脂質(zhì)的靶向分析,選擇性的脂質(zhì)提取通常需要多種方法相結(jié)合,如LLE與SPE等。減少有機溶劑用量、使用低毒或無毒溶劑、操作簡便快速、提高萃取效率、提升自動化水平等已成為脂質(zhì)提取方法的發(fā)展趨勢。針對樣品中不易檢測的物質(zhì),化學衍生化提供了一種可行的策略。該策略中,衍生化試劑的確定及合成方法是關(guān)鍵,也決定了方法的實用性和可推廣性。因此,新型、普適性或特異性的衍生化試劑的開發(fā)成為主要發(fā)展方向,需兼顧試劑原料易得性、合成條件溫和、反應(yīng)速度快、效率高等特點。不同類型的脂質(zhì)及其表達量與諸多疾病密切相關(guān),優(yōu)良的樣品前處理技術(shù)對于提升脂質(zhì)組學數(shù)據(jù)質(zhì)量、研究脂質(zhì)生理功能、發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)相關(guān)疾病標志物等研究提供重要的技術(shù)支撐,對脂質(zhì)組學的發(fā)展具有重要意義。